肝癌细胞间隙连接蛋白Cx32，Cx43的流式细胞仪分析
细胞与分子免疫学杂志 1999年第1期第0卷 研究简报
作者：马向东 隋延仿 王文亮 徐力青
单位：马向东 隋延仿 王文亮 徐力青（第四军医大学病理学教研室,西安710032）
细胞间隙连接(gapjunction)基因是最近发现的另一类非突变型抑癌基因[1]。通过该基因表达的蛋白产物—间隙连接蛋白(connexin,Cx)所构成的间隙连接通道，进行相邻细胞间能量和信息的传递,在细胞生长、分化控制中起重要的作用[2]。同时，Cx表达的降低与多种肿瘤的形成及恶性程度相关[3]。我们对其中Cx32，Cx43与肝癌细胞发生的关系进行了研究。
1 材料和方法
1.1 细胞系 人肝癌细胞系HHCC，SMMC－7721及正常人肝细胞系QZG，由中国科学院上海细胞生物所提供。以含100ml/L热灭活胎牛血清（美国Gibco公司)、1×105IU/L青霉素及1×105IU/L链霉素的RPMI－1640培养液（美国Gibco公司)常规培养。
1.2 抗体 小鼠抗人Cx32mAb及小鼠抗人Cx43 mAb 为美国 Zymed 公司产品。FITC标记的羊抗鼠mAb IgG，为美国Zymed公司产品。FITC无关小鼠购于北京中山公司。
1.3 间接免疫荧光染色 ①收集1×109/LHHCC，SMMC－7721和QZG细胞，分别加入20ml/L正常山羊血清的RPMI－1640培养液，于4℃封闭30min。②分别加入过量抗Cx32mAb，抗Cx43mAb；QZG细胞加入无关小鼠mAbIgG作为阴性对照，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。③加入1∶100FITC标记的羊抗鼠mAbIgG，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。
1.4 流式细胞仪分析 将细胞制成500μl单细胞悬液，过300目筛网，用ELITEESP流式细胞仪（美国Coulter公司）进行抗原检测。
2 结果
HHCC，SMMC－7721和QZG细胞中，Cx32，Cx43蛋白的免疫荧光检测结果见图1～3。QZG细胞加入无关小鼠 mAbIgG的阴性对照，细胞无阳性表达。Cx32和Cx43蛋白阳性细胞计数率的比较，结果见表1。
表1 3种细胞系Cx32，Cx43蛋白阳性细胞计数（％）
| 细胞系 |
阳性细胞计数率（％） |
| Cx32 |
Cx43 |
| HHCC |
1.9 |
7.3 |
| SMMC－7721 |
1.7 |
2.3 |
| QZG |
99.0* |
99.1* |
*与HHCC及SMMC-7721相比较，P＜0.01
图1 HHCC细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.9％;B:为Cx43蛋白阳性细胞计数率7.3％
图2 SMMC－7721细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.7％；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率2.3％
图3 QZG细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率99.0％；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率99.1％
3 讨论
间隙连接几乎存在于哺乳动物的所有组织、细胞中。目前已克隆出该基因家族中至少有13个成员，其基因序列有高度同源性，其在各组织、细胞间的表达，既有组织特异性，又有交叉反应性〔4〕。近来研究发现，多种肿瘤细胞不存在或仅有较弱水平的Cx表达[5]。Cx32和Cx43基因是与肝细胞密切相关的连接基因，二者在正常肝细胞系QZG中的高表达（分别为99.0％和99.1％）产物，对正常肝细胞功能的维持起主要作用。Cx32和Cx43蛋白在肝癌细胞系中的表达显著减少，HHCC中仅为1.9％和7.3％；SMMC7721中仅为1.7％和2.3％，与正常肝细胞中的高表达存在显著性差异（P＜0.01） 。以上结果充分说明，连接蛋白基因Cx32和Cx43表达的降低可导致细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）的减弱或消失，使癌细胞失去正常的生长控制，与肝细胞癌的形成密切相关，很可能是肝细胞癌形成的重要分子机制。
作者简介：马向东，女，28岁，住院医师，博士生
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374547
参考文献
［1］Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N,et al. Altered homologous and heterologous gap－junction intecellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin 32. Int J Cancer, 1994;54: 87～94
［2］Kumar NN, Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell, 1996; 84: 381～388
［3］Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cancer. Cancer Res, 1993; 53: 3475～3485
［4］Haefliger JA, Bruzzone R, Jenkins NA，et al. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. J Biol Chem,1992; 267(3): 2057～2064
［5］Tsuda H, Asamoto M, Baba H,et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with a decrease in connexin 32 expression. Carcinogenesis,1995;16(1): 101～105
（收稿 1998－04－22 修回 1998－05－20）
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