体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性
第三军医大学学报2000年第22卷第6期
宋志强 郝飞 闵峰 马巧玉 王宇明 刘国栋
摘 要： 目的 建立支持HCV体外长期复制的细胞培养体系，研究其体外复制和表达特性。方法 将HCV感染血清接种人肝癌细胞系7721后，以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内HCV的感染和复制情况。结果 细胞内和培养上清中在孵育后的3月余均可间断地检测出HCV正链和/或负链RNA，多种HCV抗原在细胞内能稳定表达；HCV rNA和抗原多位于胞浆中。结论 HCV在7721细胞系中的复制和表达与体内感染状态接近，此长期培养体系将是深入研究HCV的有效工具。
关键词：丙型肝炎病毒；7721细胞系；细胞培养；细胞体系；复制
建立HCV体外长期培养体系是深入、系统研究HCV的前提。近年来国内外学者的探讨表明，多种细胞均可不同程度地支持HV的体外复制，这些细胞模型的建立极大开拓了人们研究HCV的策略和途径的选择［1～5］，但这些培养体系多以非肝细胞为主，且迄今国内尚未见HCV体外培养的报道。我们在前期的研究中利用HCV感染血清体外感染培养中的人肝癌细胞系7721获得了成功［6］，为了研究体外长期培养人肝细胞中HCV复制和表达特性，我们对培养3月余的7721细胞内及其培养上清中的HCV病毒基因和/或抗原作了检测，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料1.1.1 实验血清 研究所用的感染血清均来自重庆地区丙型肝炎患者，所有血清均用Ortho抗HCV第二代ELISA试剂及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测证实抗HCV和HCV rNA为阳性。正常血清来自我院输血科健康献血员。血清无菌采集后分装并冻存于-20°C，用前经56°C30 min灭活补体。
1.1.2 免疫组化试剂 链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；HCV nS3及NS5单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供［7］，HCV cP10单克隆抗体由本室制备［8］。
1.1.3 RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒 由北京医科大学肝炎试剂中心提供。
1.1.4 原位杂交试剂 Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针序列位于HCV5′非编码区，即(-95～-56 nt)5′-CTGCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTGTGG-3′，由军事医学科学院二所制备和纯化。碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(工作浓度1∶500)、封闭试剂和NBT/BCIP液均为德国宝灵曼公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1HCV感染血清接种细胞 同时设立感染组和对照组。取细胞生长良好的培养瓶/板，移去培养基，加入HCV感染血清(感染组，感染血清终浓度为10%)或等量的正常人血清(正常对照组)或等量的生理盐水(空白对照组)，再加入适量完全培养基(含10%小牛血清)，轻轻摇匀，置入培养37°C孵育8h后，弃上清，以PRMI-1640充分洗涤4～6次，并留取最后1次洗液以待检，然后再加入培养基继续培养。感染后每5d收集部分培养上清、细胞或长有细胞的玻片(细胞爬片)。
1.2.2 细胞内及培养上清中HCV正、负链RNA的检测 采用RT-PCR方法，按操作说明书进行。简要步骤：提取HCV rNA，加入逆转录反应体系(检测正链RNA时选择负链引物，检测负链RNA时选择正链引物)，37°C60 min，95°C 5 min；在逆录产物中加入PCR反应缓冲液(含聚合酶及HCV正链或负链外引物)94°C1 min，55°C 1.5 min，72°C 2 min，60个循环后，72°C继续反应10 min，取扩增产物10μl与1 μl载样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的2%琼脂糖，于1×TAE缓冲液中，在5 v/cm的电压下电泳30 min。在紫外灯下观察145 bp处有荧光带者即为阳性。
1.2.3 免疫组化检测细胞内HCV抗原 取制备好的细胞爬片(或淋巴细胞涂片)，PBS漂洗3次，每次5 min(下同)；用0.03%H2O2-甲醇溶液37°C孵育10 min，PBS漂洗；移入含0.02%Tween20的PBS 2 min，20%的正常羊血清37°C孵育10 min，吸去多余的液体；加入HCV nS3、NS5或CP10单克隆抗体，4°C冰箱中孵育12～24 h；PBS漂洗，加生物素标记的第二抗体，37°C孵育30 min；PBS漂洗，加入S-P液，37°C孵育30 min，PBS漂洗；DAB显色3～5 min，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染，透明，封片，显微镜下观察，照相。对照实验：分别用1%小牛血清白蛋白(第一抗体稀释液)、PBS替代第一抗体做第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和S-P液作试剂替代对照。
1.2.4 原位杂交 细胞爬片(涂片)在PBS中漂洗1 min，25 mg/L的蛋白酶K消化30 min，4%的多聚甲醛室温下固定10 min，PBS漂洗1 min，2×SSC溶液漂洗15 min，50%、75%、90%、100%的乙醇序列脱水各1 min，自然风干；将含有探针的杂交液(85°C，1 ng/μl)滴加在细胞爬片上，每片约20～40 μl，用封口膜覆盖，放入湿盒内(先用50%甲酰胺浸湿的纸餐巾垫好)37°C下杂交16 h；50°C 2×SSC溶液轻轻洗掉封口膜，42°C 2×SSC溶液漂洗20 min，37°C1×SSC溶液漂洗15 min，37°C 0.1×SSC溶液中漂洗10 min，1号Dig缓冲液室温下5 min，含1.5%的1号Dig缓冲液37°C下60 min，加入1∶500稀释的DIG抗体，37°C下孵育30 min，1号Dig缓冲液漂洗5 min，2号DIG缓冲液漂洗3 min，NBT/BCIP显色，显微镜下观察确认充分显色后，PBS漂洗终止显色，50%、75%、90%、100%的乙醇系列脱水，透明，中性树胶封片，照相。替代对照；分别用不加探针的杂交液和不加抗DIG抗体的1号DIG缓冲液做对照。
2 结果
2.1 细胞生长和表型变化
培养中的7721细胞多呈椭圆形或梭形，连接成片状。接种和未接种感染血清的细胞生长均良好，细胞生长速度无明显区别，感染后细胞形态光镜下未见明显的变化。
2.2 HCV RNA的检出结果
细胞内HCV正链和负链RNA的首次检出时间分别在感染后第2天和第3天，二者的检出率接近。培养上清中正链RNA从感染后的第2天一直到第95天均可间断地检测到；培养上清中未检出负链RNA，见表1。最后1次洗液、加正常人血清的正常对照组和未加任何人血清的空白对照组均阴性。
表1 细胞内和培养上清中HCV正、负RNA的检测
tab 1 Detection of plus-and minus-strand of HCV RNA
in cultured cells and supernatant
| Time after
infection (d) |
Cells |
Supernatant |
| |
Plus-strand |
Minus-strand |
Plus-strand |
Minus-strand |
| 1 |
- |
- |
- |
- |
| 2 |
|
- |
|
- |
| 3 |
|
+ |
|
- |
| 5 |
- |
- |
+ |
- |
| 15 |
|
|
|
- |
| 20 |
|
|
|
- |
| 30 |
|
+ |
|
- |
| 40 |
- |
- |
- |
- |
| 45 |
|
|
|
- |
| 52 |
|
+ |
- |
- |
| 62 |
|
|
|
- |
| 66 |
+ |
|
+ |
- |
| 70 |
- |
+ |
- |
- |
| 80 |
+ |
+ |
+ |
- |
| 85 |
+ |
- |
+ |
- |
| 95 |
+ |
- |
- |
ND |
+:weakly positive;：positive;-:negative;ND:not detected
2.3 细胞内HCV抗原的表达
在细胞接种感染血清及传代后用S-P法检测细胞内的不同抗原的表达，可见棕黄色着色的阳性细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见；阳性物质呈细小颗粒，多呈胞浆均质型，少数呈胞浆不均质型；少数细胞核内亦可见阳性表达。光镜下阳性细胞未见形态的变化。正常对照和空白对照、免疫组化对照实验均未表达HCV抗原的阳性细胞。
2.4 感染细胞内HCV负链RNA的定位
在细胞接种感染血清后不同时间的杂交片中，可见蓝色着色的杂交阳性细胞，阳性细胞呈散在分布/点状分布，阳性物质呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式可分为浆型、核型和核浆混合型，以胞浆型为多见。空白对照组、正常对照组未见杂交信号。
2.5 细胞传代对HCV复制的影响
在感染后每隔3～5d将细胞消化后进行传代。发现传代多次后细胞内和/或培养上清中仍可检测到HCV rNA；免疫组化证实传代细胞内有HCV抗原的表达；原位杂交可见蓝色着色的杂交阳性细胞。
2.6 感染细胞分泌成熟病毒颗粒的验证
为证实7721细胞感染HCV后能分泌具有感染性的成熟病毒颗粒，我们在实验中采取了两种方案：①不同细胞的共孵育：先彻底洗去已感染HCV的7721培养体系中的培养上清，然后加入健康人的淋巴细胞及培养基继续培养，2～3d后收集淋巴细胞做HCV感染指标的检测。结果发现淋巴细胞内可检出HCV rNA和抗原表达。②用培养上清感染新鲜细胞：将7721细胞感染后的培养上清与新鲜的7721细胞共同孵育后，如前彻底洗去培养上清，收集标本检测新鲜细胞感染情况。结果显示新鲜的7721细胞及其培养上清中HCV rNA阳性，细胞内可见HCV抗原表达。
3 讨论
HCV分子生物学方面的研究已有很大进步，但其感染的机制、复制的方式及疫苗研制等尚未完全明确和解决，这主要是因为迄今一直缺乏适宜HCV感染和复制的细胞和动物模型。发展有效的体外培养体系是深入研究HCV的前提。尽管目前的研究已证实HCV可在人T细胞中长期复制，但HCV感染非肝细胞的方式和途径是否类似体内感染肝细胞，以及在非肝细胞细胞中的长期培养的HCV，其生物学特性是否已经发生改变，尚存在许多疑问［4］。
肝细胞是体内HCV感染的自然靶细胞，用自然存在于血液中的HCV直接感染培养人肝细胞建立的细胞模型可能会更接近自然感染状态，可为系统地研究HCV感染、复制、抗原表达及病毒颗粒的蛋白形成，为HCV病原学、发病机制及尤其是疫苗的筛选等方面的研究打下基础。
本研究中，我们将HCV感染血清接种7721细胞后，从细胞和/或培养上清中检出HCV的正链RNA及负链RNA(复制中间体)。我们认为细胞及培养上清中检出的HCV rNA是新复制的，而不是感染血清残留的，因为所用的感染血清中未检出负链RNA，且感染血清与细胞共同孵育8 h后经4～6次洗涤留取的最后一次洗液经RT-PCR检测证实为阴性。
我们研究发现，细胞接种感染血清后的HCV正、负RNA的出现似乎并无规律可循。正链和负链RNA在培养细胞内并非持续阳性，而是间断检出；HCV正、负链RNA可单独或同时阳性或在一段时间内均为阴性，说明HCV在体外培养细胞中的复制是间歇性的。这与丙型肝炎患者病毒血症及其他细胞培养体系的结果相似［1～4］。
Ikeda等［5］对MT-2和PH5CH细胞(人非肝肿瘤细胞系)对不同基因类型的HCV易感性所作的对比研究中发现，HCV感染某种细胞并在其中能够得到长期复制能力与细胞类型有关，即具有细胞嗜性(Cell tropism)，表现在HCV感染和复制进程中HVR1的准株逐渐转变同源性，并且仅仅是血清中一种占少数的HCV株被选择和适应在细胞内复制。我们目前正在对此培养体系做上述现象的研究。
有关HCV患者肝组织中HCV抗原和HCV RNA原位杂交的报道较多，而有关培养细胞中HCV抗原的表达和HCV rNA的定位研究报道不多。我们的结果显示，表达HCV三种抗原的细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见；抗原在细胞内的表达多呈全胞浆型和局灶型，少数细胞核亦可见阳性表达；感染细胞内存在HCV负链RNA的杂交信号呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式可分为浆型、核型和核浆混合型，以胞浆型为多见，这些现象与其他细胞培养体系及丙型肝炎患者肝组织的检测结果相似［1，2，4，9，10］，提示HCV在体外培养7721细胞中的复制及表达特征可能和体内十分接近。
培养细胞能分泌具有感染性的病毒颗粒是体外HCV培养成功的重要标志。我们在研究中证实，已感染HCV的7721与健康人的淋巴细胞共孵育后能使后者亦感染上HCV，且前者的培养上清可以再次感染新鲜的7721细胞，提示7721细胞感染HCV后可分泌具有感染性的病毒颗粒，这对进一步研究HCV病毒颗粒性状乃至可能的病毒纯化都有着重要意义。
人肝癌细胞系7721来源较易，细胞纯度好，7721细胞感染HCV后经数次传代后仍可间断地检出HCV复制和抗原表达，说明HCV在本培养体系中的复制和表达具有良好的稳定性，此细胞培养体系对深入、系统地研究HCV体外复制机制及预防性疫苗和抗病毒药物的筛选有着良好的应用前景。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670672)
作者简介：宋志强(1972-)，男，河南省上蔡县人，博士研究生，医师，主要从事分子病毒学方面的研究，发表论文8篇。电话：(023)68754187宋志强（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038)
郝飞（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038)
闵峰（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038)
马巧玉（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038)
王宇明（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038)
刘国栋（第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆400038）
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