耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm的建立

　　第四军医大学学报2000年第21卷第4期

张洪新　王执民　郭卫平　王义清　刘燕　李文献　倪代慧　关彦　高巍

　　摘　要:目的　培养建立耐药肝癌细胞模型-7721/Adm并研究其生物学特性.方 法　应用人肝癌细胞株-7721（以下简称7721细胞），采用阿霉素（Adm）大剂量间歇 诱导法，建立耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm（以下简称7721/Adm）.观察该细胞的生长规 律；用MTT法鉴定该耐药细胞模型对多种抗癌药物的多药耐药性；以流式细胞技术检测该耐药细胞模型细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因（MDR）的表达产物-P-蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白MRP及谷胱甘肽硫转移系统（GSH/GST）的表达等.结果　①经MTT法鉴定7721/Adm细 胞较HCC-7721细胞的阿霉素半数致死浓度（IC₅₀）增大4.65倍，并对多种抗癌药物产生耐药性，其耐药性提高了2～6倍不等; ②耐药细胞倍增时间明显延长，S期细胞减少，而 g2期细胞增多; ③该耐药模型P-gp,MRP表达有非常显著的升高（P＜0.01）：P-gp表达为9 4.6%,MRP表达为69.4%，而GSH/GST的表达无明显变化（P＜0.05）.结论　 ①HCC -7721/Adm是一个明确的多药耐药细胞模型；②7721/Adm细胞具有耐药细胞的基本生物学特性.

　　关键词:人肝癌细胞；多药耐药；阿霉素

　　0　引言

　　临床上许多肿瘤患者在经历了数次有效的化疗后，最终难免复发、转移，其主要原因是肿瘤细胞对药物的耐受；产生耐药性的肿瘤细胞不仅对使用过的抗肿瘤药物产生耐受，而且对多种未曾使用过的结构和作用机制不同的药物也产生耐受，这种现象称为多药耐药（multidru g resistance，MDR）. 目前对耐药机制有了一定了解^［1］.我们采用阿霉素大剂量 间歇诱导法培养建立人肝癌细胞-7721（以下简称7721细胞）的耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm（以下 简称7721/Adm），并观察了耐药模型和亲本株在诸如多药耐药性、细胞周期分布、细胞内药物浓度等生物学特性方面的变化，以及细胞表面多药耐药标志物［多药耐药基因（MDR1）的 表达产物-P-蛋白、多药耐药相关蛋白MRP及谷胱甘肽硫转移系统（GSH/GST）］,等的表达情况，报告如下：

　　1　材料和方法

　　1.1　7721细胞株的培养　人肝癌细胞株-7721（本校实验动物中心提供）在PRMI1640完全培养液（ 含200 mL·L^-1小牛血清，100 kU·L^-1青霉素，100 mg·L^-1链霉素） 、50 ml·L^-1 CO₂孵箱中培养，呈单层贴壁生长见.取对数生长期细胞，2.5 g·L^-1胰酶消化，离心，PRMI1640完全培养液制备单细胞 悬液（3×10^8.L^-1）做实验.

　　b　耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm的建立　7721 /Adm细胞的建立，采用大剂量间歇诱导法诱导7721细胞株^［2］.①取单细胞悬液（ 3×10^8.L^-1）接种96孔板，每孔1 mL；加入倍比稀释的速溶型阿霉素（意大利 Farmitalia Carlo Erba生产，浓度设为0.005,0.01,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.2 8,2.56 mg·L^-1），设3个复孔；37℃,50 mL·L^-1 cO₂条件下培养72 h；用 5 g·L^-1亚甲蓝染色固定，计数活细胞数，绘制生长抑制曲线，并得到7721细胞的阿霉素IC₅₀.② 取7721细胞（1×10^8.L^-1）接种于25 mL培养瓶，50 mL·L^-1 CO₂ ，37℃条件下培养，进入对数生长期后加入阿霉素至终浓度5 mg·L^-1，作用1 h，弃含药培养液；2.5 g·L^-1胰酶消化，1000 r·min^-1离心3 min，收集细胞，按1×10⁵个细胞 入25 mL培养瓶重新接种，加不含药培养液，继续培养数代.③待细胞生长状态良好后，按上述方法重复，直至细胞能够维持在0.5 mg·L^-1阿霉素浓度下长期培养即成为耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm.

　　1.3　生长曲线及倍增时间测定　取生长状态良好的7721细胞、7721/Adm细胞若干瓶，2.5 g·L^-1胰酶消化，离心（300 r·min^-1 ），RPMI 1640完全培养液制备单细胞悬液（3×10^8.L^-1），接种到24孔培养板中（ 1 mL/孔），37℃,50 mL·L^-1 CO₂下培养.每日取3孔细胞进行计数，连续观察7 d . 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线. 据Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：Id=Tlg2/lg（Nt/N0）; Td：倍增时间（h）; T：细胞数由N0增至Nt所用时间; n：细胞数.

　　1.4　MTT法药敏试验 　采用MTT法检测^［3］，7721细胞、7721/Adm细胞对阿霉素（ADM）、表阿霉素（EADM）、丝裂霉素（MMC）、卡泊（CDBA）、5-氟脲嘧啶（5-FU）、MTX、足叶乙甙（VP16）、长春新碱（VCR）等临床常用的抗肝癌化疗药物的敏感性. 7721/Adm细胞在不含药RPMI1640 完全培养液中培养1 mo备用. 取对数生长期的7721细胞、7721/Adm细胞，2.5 g·L^-1 胰酶消化 ，离心（300 r·min^-1），用RPMI1640完全培养液制备单细胞悬液（5×10⁸细胞 ·L^-1），分别接种到96孔板（200μL/孔，即1×10⁵个细胞）. 培养24 h后参照抗癌药物血浆高峰浓度加入不同浓度的 上述药物（设3个复孔）^［4］，37℃，50 mL·L^-1 CO₂培养24 h. 每孔加入 MTT 20 μL，37℃下继续培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL/孔，充分震荡5 min，上酶联免疫分析仪测每孔的光密度值（A值），波长490 nm.计算存活率（存活率=实验 孔/ 对照孔×100%）.以药物浓度为横轴，存活率为纵轴绘制浓度效应曲线.确定半数抑制浓度 （IC₅₀），计算耐药指数（RI）=耐药细胞IC₅₀/亲本细胞IC₅₀.

　　1.5　流式细胞仪测定细胞周期分布　生长状态良好的对数生长 期7 721细胞、7721/Adm细胞经2.5 g·L^-1胰酶消化，离心（300 r·min^-1），收 取细胞，冷PBS洗涤2次，700 mL·L^-1冷乙醇固定过夜.离心弃上清液，冷PBS洗涤 2次并重悬成1×10^8.L^-1，上DNA-prep仪，PI染色20 min，尼龙网（350目）过滤，入流式细胞仪样品室，分析细胞周期分布.

　　1.6　流式细胞仪测定胞质药物浓度　采用流式细胞技术检测7721细胞、7721/Adm细胞内阿霉素浓度^［5］.取生长状态 良好的 对数生长期7721细胞、7721/Adm细胞，2.5 g·L^-1胰酶消化，离心（300 r·min -1），分 别计数1×10⁵个细胞接种于25 mL培养瓶中，加RPMI 1640完全培养液培养48 h后，在培养液中加入阿霉素至终浓度5 mg·L^-1，培养1 h后，2.5 g·L^-1胰酶消化收取 细胞，冷PBS（4℃，0.01 mol·L^-1 pH 7.4）洗涤2 次，再重悬于冷PBS中，4℃下保存至上样行流式细胞仪检测（激发波长488 nm，接收波长57 5 nm）.

　　1.7　流式细胞仪测定细胞MDR1蛋白P-gp，MRP及GSH/GST的表达[ s T]　取7721/Adm细胞（1×10⁸个细胞·L^-1）分4组，每组4管，PBS（4℃，0.01 mol·L^-1 pH 7.4）清洗 两遍，分别加入MRK16（MDR1）、MRPrl（MRP）、GSH/GST鼠抗人单克隆抗体，以鼠抗人isot ype-matched单克隆抗体做对照（以上试剂均购于法国国际免疫技术有限公司），4℃孵育1 h，分别加入羊抗鼠荧光标记抗体（华美公司），4℃孵育30 min，上流式细胞仪进行荧光测定.

　　统计学处理:方差分析，Q检验.

　　2　结果

　　2.1　生长抑制曲线　以阿霉素梯度浓度为X轴,细胞均数为Y轴绘制7721细胞和7721/Adm细胞第1～7日的生长抑 制曲线. 得到该细胞的IC₅₀分别为0.215和1.00，7721/Adm细胞的耐药性是7721细胞的4.65倍.

　　2.2　生长曲线和倍增时间　7721细胞、7721/Adm细胞(3×10⁸个细胞·L^-1)分别接种到24孔板,设3个复孔,分别计数培养1～7 d的3个复孔的细胞均数,以日数为X轴,细胞数为Y轴绘制生长曲线,并得到其细胞倍增时间分别为80.6 h,336.0 h，耐药细胞的倍增时间延长4.2倍

　　2.3　7721细胞和7721/Adm细胞的药物敏感性　 7721/Adm细胞对ADM,EADM,VCR,MMC,VP-16,CDDP均有明显的抗药性，对MTX,5-FU抗药性不明显(Tab 1).

表 1　7721细胞和7721/Adm细胞的药敏性

　　tab 1　Cross-resistance：IC₅₀ and resistance index for 7721 and7721/Ad m cells

　　2.4　细胞周期分布　7721细胞经阿霉素大剂量间歇诱导获得耐药性以后，对数生长期的增殖速度减慢. 经流式细胞仪进行细胞周期分布分析发现：7721/Adm细胞G1期、G2期细胞明显增多，而S期有所减少(Tab 2).

表 2　7721细胞和7721/Adm细胞的细胞周期变化

　　tab 2　Cell cycle of 7721 and 7721/Adm cells

　　2.5　阿霉素抗肿瘤药物对细胞周期分布的影响　肿瘤产生多药耐药性是其自身发生一系列生物学改变的结果.细胞周期分布 的改变可能有利于其逃避抗肿瘤药物的细胞毒作用.因此我们观察了阿霉素作用前后敏感细胞和耐药细胞的周期分布变化. 用0.5 mg·L^-1阿霉素作用于7721细胞、7721/Adm细胞,12 h 后收集细胞,流式细胞仪观察其细胞周期分布的改变(Tab3).

表 3　阿霉素对7721细胞和7721/Adm细胞周期分布的影响

　　tab 3　Cell cycle effect of ADM on 7721 and 7721/Adm cells

　　2.6　细胞内阿霉素药物浓度测定　7721细胞、7721/Adm细胞在含5 mg·L^-1阿霉素的培养液中培养1 h，然后换无药培养液继 续培养30 min后收获细胞,利用流式细胞仪检测细胞内阿霉素荧光强度分别为(95.2±3.40)%和(62.7±8.1)%. 7721/Adm细胞内阿霉素的荧光强度明显低于7721细胞，说明7721/A dm细胞与7721细胞相比细胞内阿霉素的蓄积明显减少（32.5%）.

　　2.7　流式细胞技术测定细胞表面MDR1,MRP,GSH/GST表达的变化　7721/Adm细胞的MDR1基因表达产物P-蛋白、MRP蛋白在膜上表达较7721细胞显著提高（P＜0.01），而GSH/GST的表达无明显变化（P＞0.05,Tab4).

表 4　流式细胞分析P-GP,MRP及GSH/GST荧光细胞染色率

　　tab 4　Expression rate of P-Gp,MRP and GSH/GST in 7721 and 7721/Adm cells　　(X±s)

　　3　讨论3.1　耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm的培养建立　迄今为至,体外诱导的MDR细胞系仍然是研究导致肿瘤产生耐药性的生物学及细胞分子生物学变化的基础. 体外诱导肿瘤MDR细胞系的方法分为两种^［2］：①药物浓度递增法( Stepwise selection)，使肿瘤细胞在低于其致死浓度的药物中持续培养，然后逐渐增加药物浓度，直至肿瘤细胞获得稳定的耐药性；②大剂量药物间歇诱导法(pulse treatment selecti on)，细胞先用突变剂处理，再给予超过其致死浓度的药物，短时间作用后改用无药培养基使其继续生长，经反复诱导存活细胞，可产生稳定的耐药性.浓度递增法诱导的耐药细胞需维持培养于含相应剂量诱导药物的培养液中,而大剂量药物间歇诱导法给药方式与临床化疗相似，诱导的耐药细胞长期培养于无药培养液中仍能保持稳定的耐药性且细胞生物学特点改变较少. 正因如此，本题采用了大剂量药物间歇诱导法，历经8个多月，培养建立了耐药人肝癌细胞模型-7721/Adm. 7721/Adm细胞对阿霉素的耐药性为7721细胞的4.65倍，表现较为稳定的耐药性；药物敏感性实验表明，7721/Adm细胞同时对多种未接触过的结构、功能及作用机制不同的药物也产生了耐药性，亦即产生了多药耐药性.细胞产生多药耐药性的基础与细胞基因突变有关^［6,7］.突变剂可增加突变发 生的机率 . 本实验直接用ADM作用于7721细胞诱导建立了耐药细胞模型-7721/Adm.阿霉素作用于DNA的抗肿瘤药物本身就具有突变剂的作用，可诱导细胞基因突变，从而引起与耐药有关的蛋白质结构、功能或表达水平发生改变、产生耐药性.

　　3.2　7721/Adm细胞的耐药机制分析

　　3.2.1　7721/Adm细胞内阿霉素蓄积减少　20世纪60年代以来,研究者们对肿瘤细胞产生耐药性的细胞分子生物学基础进行了不断的研究. 已 知导致肿瘤细胞产生多药耐药性的原因主要包括：①肿瘤细胞多药耐药基因（multidrug re sistance，MDR）的扩增及其产物-P-糖蛋白（p-glycoprotei，p-gp）的高表达^［1］；②多 药耐药相关蛋白（multidrug resistanceassociated protein，MRP）基因的扩增及其产物M RP的表达^［8］；③非典型MDR,DNA拓扑异构酶II活性的改变^［9］;④谷胱甘肽流转移系统（GSH/GST）含量增高，活性增强^［4］.但是肿瘤的耐药机制是错综复杂的，不同的细胞经不同药物作用后产生的耐药表型存在差异，其产生机制还未能阐明.细胞内药物蓄积减少是最先发现的、也是最常见的导致肿瘤耐药的原因^［1］.耐药 细胞表面P-gp的发现使人们认识到药物泵对药物的主动外运是细胞内药物蓄积减少的主要原因^［10］.本实验流式细胞仪内阿霉素荧光强度分析表明，7721/Adm细胞内药物蓄积明显低于7721，提示细胞内药物蓄积减少可能是7721/Adm产生多药耐药性的主要机制. 细胞内药物蓄积的减少可能是膜通透性改变以致细胞对药物摄入减少或细胞内药物外流增加的结果.

　　3.2.2　7721/Adm细胞表面耐药标志物变化　研究证实，许多耐药细胞表面均有P-gp过度表达.本实验采用单克隆抗体、流式细胞技术 测 定细胞表面MDR1基因表达产物P-gp变化，结果显示：7721/Adm细胞的MDR1基因表达产物P -蛋白在膜上表达较7721细胞显著提高（P＜0.01），提示P-gp高表达可能是造成7721/Ad m细胞内阿霉素药物蓄积减少、从而构成耐药性的一个分子基础.研究证实许多耐药细胞表面均有P-gp过度表达，但也有一些MDR细胞,胞质内药物蓄积减少而 细胞表面P-gp表达并未增多，提示还存在着P-gp以外的耐药机制. mRP的发现解释了部分n on -P-gp 介导的多药耐药现象^［11］. mRP介导的多药耐药性机制与P-蛋白不完全相 同；MRP不仅表达于细胞表面，也可表达于胞质内质网上，一方面减少药物蓄积，另一方面使进入细胞内的药物局限于胞质小室内，使抗肿瘤药物不能与靶分子结合而失去细胞毒作用. mRP减少细胞内药物蓄积、改变细胞内药物分布是一种重要的多药耐药机制.在多数实验中,阿霉素诱导的耐药细胞具有non-P-gp介导的多药耐药性，因此我们设想7721/ Adm细胞膜表面可能会有MRP的过度表达. 我们利用单克隆抗体MRPrl（MRP）^［12］检测7721细 胞、7721/Adm细胞MRP的表达，流式细胞仪间接免疫荧光强度分析表明7721/Adm细胞MRP表达阳性率高于7721细胞， MRP过度表达可能是造成7721/Adm细胞内阿霉素蓄积减少、从而构成7721/Adm细胞耐药性的另一分子基础. 7721/Adm细胞有无其他膜蛋白过度表达以及MRP过度表达是基因扩增的结果还是转录、转录后激活的结果有待进一步研究.

　　有报道发现细胞内GSH水平可调节MRP对药物的主动外运，提示GSH/GST系统可能与MRP表达 或MRP功能有关^［13］. 我们利用GSH/GST鼠抗人单克隆抗体检测7721细胞、7721/Ad m细胞内G SH/GST活性的改变，结果显示：7721/Adm 细胞内GST活性与7721细胞相比GSH/GST的表达无明显差别（P＞0.05）. 阿霉素诱导的MDR细胞常出现GST活性升高，Schneider等^{［ 14］}诱导的 耐药细胞MCF7/VP过度表达MRP而GST活性并未升高，与本实验结果相似，提示GST活性升高与 mRP过度表达在耐药细胞中不一定会同时出现，GST活性改变可能与7721/Adm耐药性的形成 无关.

　　基金项目:陕西省攻关课题部分资助（CX99A016)

　　作者简介：张洪新(1969-)，男(汉族),吉林省蛟河县人.主治医师,讲师,硕士，发表论文15篇. Tel.(029)3577754

　　张洪新（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西西安 710038)

　　王执民（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安710038)

　　郭卫平（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安710038)

　　王义清（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安710038)

　　李文献（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安710038)

　　倪代慧（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安710038)

　　关彦（第四军医大学唐都医院:介入放射科，陕西 西安 710038)

　　刘燕（第四军医大学唐都医院:眼科,陕西 西安 710038)

　　高巍（第四军医大学唐都医院:消化内科，陕西 西安 710038）

　　参考文献:

　　［1］ Longhurst TJ,O′Neill GM, Harvie RM et al. The anthracyl cine resistance-associated(ara) gene, a novel gene associated with multidrug re sistance in a human leukaemia cells line［J］. Br J Cancer,1996;74:1331-1335.

　　［2］ Yang LY, Trujillo JM. Biological characterization of multidrug-re sistant human colon carcinoma sublines induced/selected by two methods［J］. C ancer Res, 1990;50:3218-3225.

　　［3］ Sargent JM，Taylor CG. Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid lekaemia［J］. Br J Cancer, 1989；60：206-211.

　　［4］ Waxman DJ. Glutathione S-transferases:Role in alkylating agent re sistance and possible target for modulation chemotherapy-a review［J］. Cancer res, 199 0;50:6449-6454.

　　［5］ Isobe H, Wellham L, Sauerteig A et al. Doxorubicin retention a nd chemoresistance in human mesotheliome cell lines［J］. Int J Cancer, 1994;57:581-585.

　　［6］ Choi K, Chen Lj, Kriegler M, Roninson IB. An altered pattern of cr oss-res istance in multidrug-resistant cells results from spontaneous mutations in the mdr (P-glycoprotein)gene［J］. Cell, 1988;53:519-529.

　　［7］ Cardarelli CO, Aksentijevich I, Pastan I, Gottesman MM. Differenti al effects of P-glycoprotein inhibitors on NIH3T3 cells transfected with wild- type(G185) or mutant(V185) multidrug transporters, 1995;55:1086-1091.

　　［8］ Kazuya E，Yoshihiko M，Yuji I et al. Multidrug resistance asso ciated prote in expression in clinical gastric carcinoma［J］. Cancer（Suppl），1996;77：1681.

　　［9］ Zwelling LA，Mayes J，Deisseroth K et al. A restriction frag ment length poly morphism for human topoisomerase II：Possible relationship to drug resistance［J ］. Cancer commun，1990;2：357.

　　［10］ Hamada H, Tsuruo T. Charaterization of the ATPase activity of the Mr1700 0 0 to 180000 membrane glycoprotein (P-glycoprotein) associated with multidrug re sistance in K562/ADM cells, 1988;48:4926-4932.

　　［11］ Flens MJ, Zaman GJR, Scheper RJ et al. Tissue distribution of the mul tidrug resistance protein［J］. Am J Path, 1996;148:1237-1241.

　　［12］ Lai PBS, Ross JA, Fearon KCH et al. Cell cycle arrest and induction o f a poptosis in pancreatic cancer cells exposed to eicosapentaenoic acid in vitro［J］. Br J Caner, 1996;74:1375-1383.

　　［13］ Zhou T, Evans AA, London WT et al. Glutathione S-transferase express ion in h epatitis B virus-associated human hepatocellular carcinogenesis［J］. cancer Res, 1997; 57(13): 2749-2753.

　　［14］ Schnerder E, Yamazaki HY, Sinhe BK, Coroan KH. Buthionine sulphoximine-m eliated sensitisation of etoposide-resistant human breast cancer MCF7 cells ove rexpressing the multidrug resistance-associated protein inodves inereased drug accumulation［J］. Br J Cancer, 1995;72:82-89.