转乙型肝炎病毒x基因肝癌细胞株的建立

　　中华实验外科杂志2000年第17卷第3期

闵军　陈积圣　刘彦文　罗树红　余新炳

　　摘　要　目的　建立表达转乙型肝炎病毒x基因(HBx)的人肝癌细胞株，为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供模型。方法　以聚合酶链反应(PCR)法从3.2 kb 乙型肝炎病毒(HBV)全基因组中扩增HBx基因，亚克隆至逆转录病毒载体，磷酸钙共沉淀法将其导入包装细胞系，以含病毒的培养上清感染人肝癌细胞系QGY7701，新霉素(G418)筛选，PCR与反转录PCR(RT-PCR)鉴定。结果　PCR法从HBV基因组扩增出518 bp片段，序列分析证实其中含HBx基因全编码序列；用逆转录病毒将HBx基因转导QGY7701细胞系，G418筛选4～6周后出现阳性克隆株QGY/HBx，PCR法从其基因组中鉴定出全长HBx基因整合，RT-PCR证实细胞有HBx mRNA的稳定表达。结论　建立了稳定表达HBx基因的肝癌细胞株QGY/HBx。

　　关键词：癌，肝细胞　乙型肝炎病毒x基因　逆转录病毒载体　转基因细胞模型

　　我们采用逆转录病毒载体建立稳定表达HBx基因的人肝癌细胞株，为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供细胞模型，现将结果报道如下。材料与方法

　　1.实验材料：携3.2 kb全长人HBV基因组质粒pT7T3HBV、逆转录病毒载体pLNSX、PA317包装细胞系和小鼠成纤维细胞系NIH3T3均为本室保存；人肝癌细胞株QGY7701购自上海中科院细胞库；G418购自Boehringer mannheim公司，Polybrene为Sigma公司产品，限制性内切酶和PCR试剂购自华美生物工程公司。

　　2.HBx基因克隆：根据HBx基因全序列设计引物，5′端引物为：5′-GGAAGCTTCATATGGCTGCTAGGCTG-3′；3′端引物为：5′-TGAAGCTTAGATCTTGAACAGTAGGA-3′，引物两端均含HindⅢ酶切位点，扩增片段长度为518 bp。以质粒pT7T3HBV为模板，PCR反应体积为100 μl，其中含2.5 mmol/L4×dNTP 8 μl，5′和3′引物各100 pmol，Taq酶3 U，反应条件为94 ℃45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环。反应结束后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，DEAE膜回收片段，进行序列分析。

　　3.重组逆转录病毒的构建：PCR产物HindⅢ酶切，与HindⅢ酶切和5′去磷酸化的pLNSX质粒连接，构建重组质粒pLNSHBx。用磷酸钙共沉淀法将质粒转染PA317细胞，收集培养上清，以其感染NIH3T3细胞测定病毒滴度。本组pLNSX产生的病毒滴度为2.3×10⁸ cFU/L，pLNSHBx为8.9×10⁷ CFU/L。

　　4.肝癌细胞株的基因转导与筛选：在细胞密度为60%～80%QGY7701肝癌细胞上加入2×10⁵ cFU重组病毒和终浓度为4 mg/L的Polybrene，吸附3 h后，加入5 ml完全培养基继续培养48 h后传代，再用含300 mg/L G418的培养液选择培养，每3 d换液1次，逐渐加大G418浓度至600 mg/L，继续培养直到抗性克隆形成。

　　5.细胞基因组中目的基因的检测：酚-氯仿抽提法提取细胞基因组DNA，按以上方法进行HBx基因PCR反应。

　　6.目的基因表达的检测：一步法提取细胞总RNA，再进行RT-PCR反应。在20μl总反应体积中加入总RNA样品5 μg，10×逆转录酶缓冲液2 μl，RNasin20 U, 2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，Oligo(dT)2 μl, AMV逆转录酶5 U，置42 ℃水中反应1 h，取此逆转录反应液2 μl作为模板，进行HBx基因PCR反应，以甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内对照。反应产物在10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳鉴定。

　　结　　果

　　1.HBx基因克隆：PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见1条特异条带位于DNA分子量标准515 bp处，与预计长度(518 bp)相符；对此特异片段进行直接测序，证明此片段中包含HBx基因全编码序列。

　　2.重组逆转录病毒载体的构建与鉴定：挑取筛选后的重组克隆1和2进行HindⅢ和BamHI单酶切鉴定。重组体1和2经HindⅢ酶切均切出约500 bp片段，表明HBx基因已成功进入pLNSX载体中。pLNSX与HBx连接可能有两种方式，即正向连接和反向连接。pLNSX于2786 bp处有1个BamHI单酶切点，HBx基因在距起始密码子30 bp处也有1个BamHI单切点，因此，重组克隆经BamHI单酶切后，正向连接者产生6265 bp与382 bp 2个片段，而反向连接者则产生5 829 bp和818 bp 2个片段。对重组质粒进行BamHI单酶切鉴定，结果1号重组子为正向连接，命名为pLNSHBx；2号重组子则为反向连接，命名为pLNSHBx^AS。

　　3.转HBx基因肝癌细胞株的筛选：将重组逆转录病毒上清感染QGY7701人肝癌细胞株，经G418筛选，4～6周时克隆形成，收集细胞扩大培养，将pLNSX转染的细胞株命名为QGY/Neo，将pLNSHBx转染的细胞株命名为QGY/HBx。

　　4.转HBx基因肝癌细胞株的鉴定：提取QGY/Neo和QGY/HBx细胞基因组DNA，以HBx基因引物进行PCR扩增，QGY/HBx细胞扩增出特异的500 bp左右片段，表明HBx基因已整合到细胞的基因组中。提取2种细胞总RNA，进行RT-PCR，2种细胞的GAPDH基因扩增均为阳性，HBx基因的扩增结果显示，QGY/HBx细胞为阳性，QGY/Neo细胞则为阴性，说明QGY/HBx细胞中有HBx mRNA的转录表达。

　　讨　　论

　　多年来，有关HBx基因的研究主要集中在HBx基因致癌机制上，关于HBx基因与肝癌细胞生物学行为间关系的研究则尚未见报道。临床病理研究显示，HBx基因在肝癌组织中具有较高的阳性率和整合率^［1］。但HBx基因在肝癌中这种持续高表达对肝癌细胞一些生物学表型如高度的增殖和转移潜能、广泛的耐药行为等是否有潜在影响，目前尚不清楚。

　　在本研究中，我们采用逆转录病毒载体将HBx基因转染人肝癌细胞株QGY7701，通过体外筛选，获得转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx。经用RT-PCR和PCR技术鉴定，证明QGY/HBx细胞不仅具有HBx mRNA的转录表达，而且其基因组中有HBx基因的整合，说明QGY/HBx是可稳定表达HBx基因的肝癌细胞株，并且由于HBx基因已整合在细胞基因组中，HBx阳性表型也可在细胞传代过程中稳定遗传。因此，本研究建立的转基因肝癌细胞株QGY/HBx是研究HBx基因与肝癌细胞生物学行为间关系的良好细胞模型。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700135，39970718)；国家教委博士点基金资助项目(9750)

　　作者单位：闵军（510120广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院肝胆外科）

　　陈积圣（510120广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院肝胆外科）

　　刘彦文（中山医科大学分子原虫实验室）

　　罗树红（中山医科大学分子原虫实验室）

　　余新炳（中山医科大学分子原虫实验室）

　　参考文献

　　［1］梁小浣，汤钊猷，张予，等.乙型肝炎病毒x基因在肝癌中的表达.中华微生物杂志，1990，10：341-359.