Ⅰ型细胞间粘附分子mRNA表达与肝癌侵袭转移的关系

　　第二军医大学学报1999年第20卷第10期

　　曲增强　吴孟超　陈汉　方石岗　钱其军　郭亚军

　　摘　要　目的：研究Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。方法：采用原位分子杂交及Northern blot方法检测34例肝癌组织中ICAM-1 mRNA 的表达。结果：34例肝癌中24例包膜不完整、门静脉癌栓或形成转移灶,10例肝癌包膜完整,34例肝癌中21例肝癌细胞ICAM-1 mRNA表达阳性。伴门静脉癌栓或形成转移的肝癌18例中，16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)；6例包膜不完整的肝癌3例表达阳性，而10例包膜完整的肝癌仅有2例表达阳性。门静脉癌栓及肝内转移灶ICAM-1 mRNA表达强阳性。结论：肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭转移相关。

　　关键词：Ⅰ型细胞间粘附分子　肝细胞癌　侵袭　转移

　　恶性肿瘤侵袭及转移的确切机制迄今尚未明确。粘附分子在肿瘤转移的多个环节中，如癌细胞从母瘤脱离、侵入和穿出血管等过程中发挥重要作用^［1］。本研究以原位分子杂交及Northern印迹杂交方法观察Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)在不同类型肝癌中的表达及分布，并初步探讨肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料　取自手术切除部分的原发性肝癌标本共34例，均经病理证实。34例肝癌中24例包膜不完整，其中18例伴门静脉癌栓或形成转移灶，6例肝癌突破包膜向周围肝组织侵袭性生长；10例肝癌包膜完整，未见癌向包膜外侵袭性生长。对照的5例标本取自肝血管瘤周围的正常肝组织。

　　1.2　标本处理　癌及癌旁组织标本离体后30 min内液氮速冻，OCT包埋，-20℃连续恒温冷冻切片(6 μm)数张，4％多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，-70℃保存。标本分别用于苏木精-伊红(HE)染色、原位杂交及Northern印迹杂交。

　　1.3　主要试剂　人ICAM-1 cDNA质粒探针长度1.6 kb，HindⅢ/BamHⅠ双酶切回收。地高辛标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。核素探针标记试剂盒购自Promega公司。α-³²P dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。

　　1.4　实验方法

　　1.4.1　原位分子杂交　以DIG随机引物法标记DNA探针，原位杂交操作流程参照文献［2］，杂交探针浓度约为1 μg/ml。镜下观察细胞出现蓝色颗粒为阳性。高倍镜下任取4个不同视野各计数200个细胞，阳性细胞所占的百分率＜30％为(+)；30％～50％为(++)，＞50％为(+++)。

　　1.4.2　Northern印迹杂交　按Chomczynski的一步法提取组织总RNA，以³²P随机引物法标记DNA探针，按文献^［3］进行Northern印迹杂交，放射自显影结束后，以缓冲液洗去硝纤膜上的放射性标记探针，硝纤膜以³²P标记的GAPDH探针重新杂交及放射自显影。

　　1.5　统计学处理　结果经秩和检验处理。

　　2　结　果

　　2.1　原位杂交　正常肝仅在血管内皮细胞、部分间质细胞中ICAM-1 mRNA表达阳性。34例肝癌中共21例癌细胞表达阳性；24例包膜不完整的肝癌中19例癌细胞表达阳性，其中伴门静脉癌栓或发生转移的肝癌18例中16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)，6例包膜不完整的肝癌中3例癌细胞表达(＋)，而10例包膜完整的肝癌仅有2例癌细胞表达(＋)(表1)。向周围肝组织浸润性生长的肝癌细胞、门静脉癌栓及肝内多个转移灶表达均呈强阳性。

表1　34例肝癌ICAM-1 mRNA的表达

　　Tab 1　The ICAM-1 mRNA expression in 34 HCC cases

　　^**P＜0.01 vs well capsulated group

　　2.2　Northern印迹杂交　正常肝组织ICAM-1 mRNA表达很低，部分侵袭性肝癌组织ICAM-1 mRNA的表达明显高于癌旁，伴癌栓形成的数例肝癌，ICAM-1 mRNA表达明显增高，而且癌栓及肝门转移淋巴结ICAM-1 mRNA表达高于原发灶(图1)。

1　ICAM-1 mRNA Northern印迹杂交

　　Fig 1　ICAM-1 mRNA Northern blot

　　C：Cancer tissue； P：Pericarcinomatous tissue；

　　E：Portal cancer emboli

　　3　讨　论

　　肝癌细胞早期侵袭转移是原发性肝癌术后高复发率的主要原因，因此，有必要研究影响肝癌细胞侵袭及转移的因素。

　　ICAM-1为相对分子质量7～11万的糖蛋白，介导细胞与细胞间的相互作用，其天然配体为白细胞功能相关抗原1(LFA-1)^［4］。近年ICAM-1在肿瘤转移方面的研究表明，黑素瘤、胃癌等肿瘤ICAM-1的高表达与其转移相关。Miele等^［5］报道以TNFα，IFNγ处理黑素瘤细胞使其ICAM-1表达上调，其形成肺转移灶的能力显著增强。以反义核酸阻断肿瘤细胞ICAM-1的表达，其形成肺转移灶的能力降低41%～64%，而且先以反义核酸阻断黑素瘤细胞ICAM-1的表达，再以TNFα，IFNγ处理，其形成肺转移灶的能力并不增强。这些结果均表明ICAM-1的表达与某些肿瘤的转移相关。

　　本研究结果表明大部分侵袭性肝癌ICAM-1 mRNA均有较高水平的表达，原位杂交及Northern blot均显示转移灶及癌栓ICAM-1 mRNA表达明显高于癌旁并稍高于原发灶，而包膜完整的肝癌仅有少部分ICAM-1表达阳性，提示肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭及转移有关。

　　肝癌细胞产生的ICAM-1在其转移过程中的确切作用尚不清楚。推测ICAM-1在肝癌转移的多个环节发挥作用。由于肝癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)LFA-1表达阳性，高表达ICAM-1的肝癌细胞可能通过与其配体LFA-1结合，从而使肿瘤细胞与TILs紧密结合，这可能导致癌细胞间粘附力降低，从而易于随淋巴细胞的迁移而脱离母瘤进入血循环或淋巴循环^［6］。本实验中癌栓ICAM-1表达强阳性，这一结果支持这个观点。亦有推测ICAM-1表达阳性的肿瘤细胞在血循环中通过ICAM-1与LFA-1的相互作用，使肿瘤细胞与外周血淋巴细胞形成栓子，使其易于在循环中逃避机体的免疫排斥作用，而且形成的癌栓易于在毛细血管或淋巴窦着床形成转移^［7］。由于发现合并转移的肾细胞癌及乳癌患者血中ICAM-1明显高于无转移者^［8］，因此推测从肿瘤细胞脱落的ICAM-1在血循环中可能阻断细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤细胞的粘附，使CTL不能有效地杀死肿瘤细胞。

　　文章编号：0258-879X(1999)10-0740-03

　　作者单位：第二军医大学东方肝胆外科医院介入科，上海，200438

　　 参考文献

　　1　Vanten-Horst E，Danen EHJ，Smit L，et al. Expression of CD44 splice variants in human cutaneous melanoma and melanoma cell lines is related to tumor progression and metastatic potential［J］. Int J Cancer，1995，64(2):182

　　2　苏慧慈 主编. 原位杂交［M］. 北京:中国科学技术出版社,1994. 59～91

　　3　Davis LG, Kuehl MW， Bettey JF. ed. Basic methods in molecular Biology［M］. 2nd. Appleton and Lange,1994. 232～234

　　4　Obiri NI, Tandon N, Puri RK. Up-regulation of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) on human renal cell carcinoma cells by interleukin-4［J］. Int J Cancer, 1995,61(5):635

　　5　Miele ME,Bennett CF,Miller BE,et al.Enhanced metastatic ability of TNF-alpha-treated malignant melanoma cells is reduced by intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1,CD54) antisense oligonucleotides［J］. Exp Cell Res,1994,214(1):231

　　6　Johnson JP, Stade BG ,Holzmann B, et al. De novo expression of intercellular adhesion molecule 1 in melanoma correlate with increased risk of metastasis［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(2):641

　　7　Natali P, Nicotra MR , Cavaliere R, et al. Differential expression of intercellular adhesion molecule 1 in primary and metastatic melanoma lesions［J］. Cancer Res,1990,50(4):1271

　　8　Jackson AM, Alexandrov AB, Gribben SC, et al. Expression and shedding of ICAM-1 in bladder cancer and its immunotherapy［J］. Int J Cancer,1993,55(6)921