人肝癌细胞系7721丙型肝炎病毒体外感染模型的建立

　　中华传染病杂志1999年第17卷第4期

　　宋志强　郝飞

　　摘要　目的：建立接近体内自然感染状态并能稳定支持丙型肝炎病毒(HCV)体外长期复制的感染细胞模型。方法：将人肝癌细胞系7721与慢性丙型肝炎患者血清共温育8小时后，分别以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞和/或培养上清中的HCV RNA、HCV抗原表达及HCV RNA在感染细胞内的定位。结果：感染血清和细胞共同温育后的第2～66天，从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负链RNA，即使其间细胞传代6次，HCV NS₃、NS₅抗原在细胞内能稳定表达，原位杂交显示HCV RNA阳性物质多位于细胞浆。结论：7721细胞不但对HCV易感，而且可以稳定地支持HCV的体外长期复制，此模型可以用于HCV感染、复制机制的研究、抗病毒药物的评价及保护性抗体/疫苗的初步筛选。

　　关键词：肝炎病毒　丙型　7721细胞系　细胞培养　细胞模型　感染

　　为了深入研究丙型肝炎病毒(HCV)感染机制和筛选HCV蛋白含中和抗原表位区段，必须建立理想的感染模型。用自然存在于患者血液中的HCV直接感染培养细胞，可建立接近自然感染状态的细胞模型，适宜于HCV感染靶细胞的方式、复制机制以及中和抗体/疫苗的研究。我们用慢性丙型肝炎患者的血清感染体外培养中的人肝癌细胞系7721，不但在细胞及培养上清中检测到HCV正、负链RNA，而且发现HCV抗原能在细胞内有良好的表达，HCV的复制至少可达66天。

　　材料和方法

　　一、主要材料

　　(一) 实验血清　实验所用的感染血清3份均来自重庆地区慢性丙型肝炎患者，经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测证实HCV RNA为阳性。正常血清来自我院输血科健康献血员；细胞培养所用的小牛血清由本校试剂中心提供。血清无菌采集后分装并冻存于-20℃，用前经56℃ 30分钟灭活补体。

　　(二) 主要试剂　(1)PRMI-1640培养基购自美国GIBCO公司。(2)链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司(产品批号：81215710)。(3)HCV NS₃及NS₅单克隆抗体；RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供^［1，2］(产品批号：981102)。(4)Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针参照Bukh等^［3］的HCV 5′非编码区探针序列，即(-95～-56nt)5′-CTGCTAGCCGAC- TAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTGTGG-3′，由军事医学科学院第二研究所制备和纯化。(5)碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(工作浓度1∶500)、封闭试剂和NBT/BCIP溶液为德国宝灵曼公司产品。

　　二、实验方法

　　(一) HCV体外感染7721　同时设立感染组和对照组。取细胞生长良好的培养瓶/板，移去培养基，加入HCV感染血清(感染组，感染血清终浓度为10%)或等量的正常人血清(正常对照)或等量的生理盐水(空白对照)，加入适量完全培养基(含10%小牛血清)，轻轻摇匀，置入培养箱37℃ 8小时后，弃去上清，以1640充分洗涤4～6次，并留取最后1次洗液以待检，然后再加入培养基继续培养。培养过程中始终保持培养液总体积不变。

　　(二) 标本的收集　感染后每2～5天从培养瓶中收集部分培养上清、细胞或长有细胞的玻片(细胞爬片)，其方法如下：(1)培养上清：吸取1ml培养上清置经DEPC水处理并高温的Eppendorf管中，1 000g离心5分钟后取上清并移入另一管中(以去掉细胞碎片)，置入-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测。(2)细胞收集：弃去培养上清，1640洗涤4～6次，0.25%胰蛋白酶消化部分细胞制成细胞悬液，以50g离心5分钟，弃上清后，重悬于PBS再离心，如此反复6次(排除培养上清的干扰)，将细胞沉淀于-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测。(3)细胞爬片：用镊子取出细胞爬片，立即用PBS漂洗3次，每次30秒。然后用4%多聚甲醛固定15分钟，再用PBS漂洗3次，置-20℃保存，备免疫组化检测细胞内HCV抗原表达或原位杂交对细胞内的HCV RNA进行定位。

　　(三) 细胞及培养上清中HCV正、负链RNA的检测　采用RT-PCR法，按说明书进行操作^［2］。

　　(四) 免疫组化检测细胞内的抗原表达　取制备好的细胞爬片，PBS漂洗3次，每次5分钟(下同)；用0.03% H₂O₂-甲醇溶液37℃温育10分钟，PBS漂洗；移入含0.02% Tween20的PBS 2分钟，20%的正常羊血清37℃温育10分钟，吸去多余的液体；加入HCV NS₃或NS₅单克隆抗体，4℃冰箱中温育12～24小时；PBS漂洗，加生物素标记的第二抗体，37℃温育30分钟；PBS漂洗，加入SP液，37℃温育30分钟，PBS漂洗；DAB显色3～5分钟，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染，透明，封片，显微镜下观察，照相。对照实验：分别用1%小牛血清白蛋白(第一抗体稀释液)、PBS替代第一抗体做第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和SP液作试剂替代对照。

　　(五) 原位杂交　参照文献［3，4］，细胞爬片用PBS漂洗1分钟→25mg/L的蛋白酶K消化30分钟→4%多聚甲醛室温下固定10分钟→PBS漂洗1分钟→2×SSC溶液漂洗15分钟→50%、75%、90%、100%的乙醇序列脱水各1分钟，自然风干→将含有探针的杂交液(85℃,1ng/μl)滴加在细胞爬片上，每片约20～40μl。用封口膜覆盖，放入湿盒内(先用50%甲酰胺浸湿的纸餐巾垫好)，37℃杂交16～24小时→50℃ 2×SSC溶液轻轻洗掉封口膜→42℃ 2×SSC溶液漂洗20分钟→37℃ 1×SSC溶液漂洗15分钟→37℃ 0.1×SSC溶液中漂洗10分钟→1号Dig缓冲液室温下5分钟→含1.5%的1号Dig缓冲液37℃下60分钟→加入1∶500稀释的Dig抗体，37℃下温育30分钟→1号Dig缓冲液漂洗5分钟→2号Dig缓冲液漂洗3分钟→NBT/BCIP显色12～16小时→光镜下观察细胞内出现蓝色颗粒即为阳性细胞。替代对照：分别用不加探针的杂交液和不加抗DIG抗体的1号Dig缓冲液做对照。

　　结果

　　一、细胞内及培养上清中HCV RNA的检出结果

　　感染后细胞内HCV正链RNA在感染后第2天出现，其后在第3、15、20、30、45、52、62、66天时可检出。负链RNA的首次检出是在感染后的第3天，其检出率与正链RNA接近。培养上清中正链RNA从感染后的第2天一直到第62天均可间断地检测到；培养上清中未检出负链RNA(见表1)。最后一次洗液、加正常人血清的正常对照组和未加任何人血清的空白对照组均阴性。

表1　7721细胞内和培养上清中HCV RNA的检测

　　 注：+：弱阳性，+　+：阳性，-：阴性，ND：未检测

　　二、细胞内HCV抗原的表达

　　在细胞接种感染血清后及传代后用SP法检测细胞内的HCV NS₃或NS₅抗原，可见棕黄色着色的阳性细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见，HCV抗原在细胞内的分布多呈胞浆型(图1，2)。光镜下阳性细胞未见形态的变化。正常对照和空白对照、免疫组化对照实验均未表达HCV NS₃、NS₅抗原的阳性细胞。

　　图1　免疫组化检测表达HCV NS₅抗原的阳性细胞×200

　　图2　免疫组化检测表达HCV NS₃抗原的7721细胞×200

　　三、原位杂交

　　在细胞接种感染血清后的第3、15、30、52、62天时及传代后的第4天的杂交片中，可见蓝色着色的杂交阳性细胞，阳性细胞呈散在分布/点状分布，阳性物质呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式可分为浆型、核型和核浆混合型，以胞浆型为多见(图3)。空白对照组、正常对照组未见杂交信号。

　　图3　原位杂交法检测细胞内的HCV RNA×200

　　四、细胞传代对HCV复制的影响

　　在感染后每隔3～5天将细胞消化后进行传代。发现传代6次后细胞内和/或培养上清中仍可检测到HCV RNA；免疫组化证实传代细胞内有HCV抗原的表达(图4)；原位杂交可见蓝色着色的杂交阳性细胞。

　　图4　表达HCV NS₃抗原的7721传代细胞×100

　　五、感染后培养上清中成熟病毒颗粒的初步验证

　　取感染后第5、15或30天的培养上清与新鲜的7721细胞共同温育后，如前彻底洗去培养上清，于第2、4、6天收集标本用RT-PCR及免疫组化检测新鲜细胞感染情况。发现新鲜的7721细胞及其培养上清中HCV RNA阳性，细胞内可见HCV抗原表达，说明7721感染HCV后能分泌具有感染性的、成熟的病毒颗粒，并可感染新鲜的7721细胞。

　　讨论

　　近年来，国内外学者研究表明，多种细胞均可不同程度地支持HCV的体外复制，这些细胞模型的建立极大开拓了人们研究HCV的策略和途径的选择^［4-8］。但是必须注意，肝细胞才是HCV在体内感染的自然靶细胞，病毒感染非肝细胞的方式和途径是否类似体内感染肝细胞，以及在非肝细胞中的长期培养的HCV，其生物学特性是否已经发生改变，尚无从考证。特别是当非肝细胞的HCV感染模型用于中和实验和预防性疫苗的筛选时其结果缺乏应有的说服力^［8］。

　　本研究中，我们用HCV体外感染人肝癌细胞系7721后，从细胞和/或培养上清中检出HCV的正、负链RNA，并认为这是新复制出的，而不是感染血清残留的，根据有：1.感染血清与细胞共同温育8小时后经4～6次洗涤留取的最后1次洗液经RT-PCR检测证实为阴性；2.细胞与感染血清共同温育后的第1～2天细胞内未检出负链RNA，而此后负链RNA却可间断地检出；3.研究所用的感染血清中未检出负链RNA；4.免疫组化证实细胞内有HCV NS₃和HCV NS₅抗原表达；5.RT-PCR及原位杂交均证实细胞内存在HCV复制中间体，即负链RNA；6.我们在预实验中发现感染血清在37℃培养箱下放置3天后，再用RT-PCR检测时结果由阳性转为阴性，说明HCV RNA在体外不可能长时间存在。

　　反映HCV复制指标结果的一致性也是判断HCV体外感染肝细胞是否成功的重要依据。我们在7721细胞接种感染血清后第3、15、30、52、62天同时对感染细胞进行HCV复制指标检测。结果发现：RT-PCR在细胞内检测到HCV负链RNA时，免疫组化也显示细胞内有HCV抗原表达，同时原位杂交证实胞内存在HCV负链RNA，说明这三种检测方法在证实HCV复制上有良好的一致性。

　　我们在研究中发现，用感染后第5、30天的培养上清可以再次感染新鲜的7721细胞，提示7721细胞感染HCV后可能分泌具有感染性的、成熟的HCV病毒颗粒，同时也进一步说明HCV感染7721细胞获得了成功。

　　稳定性是良好细胞模型的必备条件。有研究表明，随着时间的延长，已感染HCV的细胞传代几次后容易丢失。我们所用的7721细胞经传代6次后仍可间断地检出HCV复制和抗原表达；已感染HCV的7721细胞经分步冻存于液氮中后，复苏后HCV仍可继续复制，这说明7721细胞可以稳定地支持HCV复制。

　　我们在实验中采用细胞爬片观察培养细胞内HCV抗原的表达和HCV RNA的定位。结果显示与丙型肝炎患者肝组织的检测结果相似^［9，10］，提示HCV在体外培养7721细胞中的复制及表达特征和体内十分接近。

　　已有的研究表明，丙型肝炎患者病毒血症可为持续性或间歇性，HCV在体外培养细胞中的复制多为间歇性。我们研究也发现，HCV正链和负链RNA在培养细胞内并非持续阳性，而是间断检出，并且HCV正、负链RNA可单独或同时阳性或在一段时间内均为阴性。当然，由于时间和经费的限制，我们仅对感染细胞中HCV RNA复制水平作动态的、定量的分析，这也是我们目前和今后要做的工作。

　　本课题受国家自然科学基金资助(编号：39670672)

　　作者单位：400038　重庆，第三军医大学西南医院全军传染病专科中心

　　参考文献

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