少精不育症患者精细胞可疑DNA片段的筛查

中华医学检验杂志 1999年第5期第22卷 论著

作者：叶锋　王建勋　袁汉尧

单位：524001 湛江，广东医学院附属医院中心实验室

关键词：少精液；序列分析；DNA

　　我们用3′端特异性引物聚合酶链反应(3′BS-PCR)分析原理，将慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清及白细胞内的乙肝病毒(HBV)前C区1 896位点突变的突变型及野生型分离，探讨HBV有意义突变中，最常见的1 896位点突变在外周血白细胞内的存在状态，结合临床进一步阐明乙肝的发病机理。

　　一、材料和方法

　　1.标本来源：经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测及HBV DNA检测均阳性的乙肝患者101例，均为我院1996年2月～1998年2月门诊及住院病例。其中男67例，女34例；年龄7～72岁，平均34.4岁。

　　2.血清及白细胞内DNA提取：血清DNA提取按常规方法进行。白细胞内DNA提取：取200 μl依地酸(EDTA)抗凝血于0.5 ml离心管中离心，弃上清，加白细胞分离液50 μl和双蒸水200 μl混匀，离心并弃上清后，用上法再重复1次。沉淀加入裂解液，置100℃水浴10分钟。

　　3.PCR引物及反应条件：采用文献^［1-3］报道的3′BS-PCR引物核苷酸序列设计原理，设计合成3条引物，第1，2两条引物的碱基位置在1 879～1 896这一区段，第3条引物的碱基位置在2 270～2 287这一区段，1，2两条引物3′端最后一个碱基分别对应于野生株和突变株，第3条引物分别与1，2两条引物构成PCR引物对。以下两对引物(分别用Ⅰ和Ⅱ表示)扩增产物长度为520 bp。在40 μl反应体系中含适量引物、dNTPs、0.01%苯磺酸、Taq-DNA聚合酶和8 μl标本。PCR经预变性共32个循环。

　　二、结果和讨论

　　1.3′BS-PCR检测白细胞内HBV DNA点突变结果。引物Ⅱ扩增HBV DNA阳性者即突变株12例，两种引物扩增均阳性者23例，均阴性者44例。突变总检出率34.5%，其中单纯突变株检出率11.8%，野生株与突变株同时检出率22.7%。

　　2.白细胞内HBV标志与血清中HBV标志的关系。目前人们对外周血单个核细胞(PBMCs)中的HBV DNA与血清中HBV DNA的关系存在着不同意见。有认为两者关系不明确，有的则认为两者有一致性的倾向。从本组白细胞内野生株与突变株同时检出的23例中，有2例在血清中未检出，单纯突变株的12例及单纯野生株的22例血清中，也各有1例未检出，可见两者之间的关系并不很明确，还有待进一步研究。但可提示血清中HBV DNA阴性的患者白细胞内不仅有野生株和突变株感染，而且突变株和野生株可同时存在。

　　3.慢性乙肝患者PBMCs内不仅普遍存在HBV DNA，而且还存在HBV突变株。从本组白细胞内野生株的总检出率44.6%(45/101)与Moraleda等PBMCs HBV DNA检出率44.4%(115/259)一致，以及本组白细胞内突变株总检出率34.6%(35/101)分析，认为：(1)用3′BS-PCR在慢性乙肝患者的白细胞中分离出野生株及突变株，是一种较能准确反映乙肝患者HBV DNA及HBV突变株存在状态的方法。(2)慢性乙肝患者白细胞内不仅普遍存在HBV DNA，同时还存在HBV突变株。

　　4.检测慢性肝炎白细胞内HBV DNA前C区突变，可能能间接地反映肝细胞内HBV DNA突变株的存在状态。有研究发现，肝细胞内HBV DNA和PBMCs内HBV DNA的存在之间有直接关系，不管患者是否经过抗病毒治疗，当肝HBV DNA逐渐消失时，带有HBV DNA的PBMCs的数量也相应减少。

　　参考文献

　　1　朱滨，王国荃.基因诊断技术进展.中华医学检验杂志，1996，19：298-299.

　　2　Goergen B. Comparison of mutation specific PCR and direct sequencing of PCR-products for the detection of the HBV pre-C stop codon. Hepatology, 1990, 16:232-233.

　　3　王小飞，刘华瑞，王锦荣，等.乙型肝炎和肝癌患者乙型肝炎病毒前C区1896位点突变的研究.中华传染病杂志，1996，14：11-12.

(收稿：1998-07-14　　修回：1998-10-08)