肾骨安治疗脊髓型颈椎病疗效及其与血清内皮素关系的实验研究
中医正骨 2000年第12期第12卷 实验研究
作者：王羽丰 邓晋丰 谭明生 许树柴
单位：广州中医药大学第二临床医学院 510120
关键词： 脊髓型颈椎病；中医药疗法；肾骨安；治疗应用；血清内皮素；实验；研究；动物兔
提要 为探讨补肾活血方药治疗脊髓型颈椎病的疗效及其 与血清内皮素(ET)之间的关系，将 44只新西兰大白兔，经C4～5椎间隙拧入螺钉造成兔颈髓腹侧慢性渐进性压迫而形成 脊髓型颈椎病模型。造模成功后，随机分为中药组及空白对照组，分别饲以添加定量中药的 饲料与普通饲料，于造模前、后及用药4周、8周各点检测ET值并处死一定数量兔行病理、光 镜检查及透射电镜观察。结果示中药组及对照组用药4周后ET值有差别(P＜0.05)；用药8周后差别显著(P＜0.01)；中药组ET值低于对照组。光镜检查示用药4周后对照组镜下病变加重，至8周时病变 严重；用药4周后中药组镜下病变无明显加重，至8周时病变较对照组明显减轻。电镜所示与 光镜结果基本相同。证明补肾活血方药能有效改善脊髓血液循环，减轻脊髓病变；ET水平高 低可反映脊髓型颈椎病病变程度及治疗效果；把ET作为脊髓型颈椎病诊断及治疗评价的一项 客观指标，值得进一步深入探讨。
中图分类号：R681.5+5 文献标识码：A
文章编号：1001-6015(2000) 12-0003-04
AN EXPERIMENTAL STUDY ON THE RELATIONSHIP BETWEEN ET AND CURATIVE EFFECT OF KIDNEY-TONIFYING AND BLOOD-ACTIVATING FORMULAE FOR CERVICAL SPONDYLOTIC MYELOPATHY
Wang Yufeng，Deng Jinfeng，Tan Mingsheng，et al
（The second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，510120）
In order to observe the relationship between endothelin(ET) and the curative effect of Kidney-tonifying and Blood-activating formulae for cervical spondylotic myelopathy(CSM), CSMs models of 44 New Zealand white rabbits were established by driving screws into C4～5 to compress the spinal cord. After operation the rabbits were allocated into two groups at random: the Chinese drug group(fed with forage mixed with herbs) and the control group(fed with normal forage). Detection of ET and observation of ultrastructral pathological studies were performed at the time of before and after model-making, 4w and 8w of treating course. Results: The ET level in the Chinese drug group showed significant difference after 4w and 8w of treating course compared with that in the control group. The histopathological studies showed that after 4w and 8w of treating course, the pathological change in the Chinese drug group had been ameliorated further, but that in the control group had aggravated severely. The ultramicroscopy studies showed the same tendencies as the histopathological ones. The results demonstrated that herbs had action to improve blood circulation of spinal cord and relieve the pathological change of spinal cord; the level of ET can reflect the pathological change of spinal cord and the curative effect of Chinese drugs.
Key Words：cervical spondylotic myelopathy therapy of TCM endothelin experimental study animal model
脊髓型颈椎病(Cervical Spondylotic Myelopathy， CSM)是40岁以 上成年人脊髓功能 障碍最常见的类型，约占颈椎病的5%～10%，可造成患者生存质量严重下降甚至危及生命， 故其研究日益引起国内外重视。对CSM的治疗，目前原则上是先进行非手术治疗，无效时则 建议手术，但手术后可灰复到何种程度尚不能预测。广东省中医院邓晋丰教授采用补肾活血 方药(肾骨安)防治CSM，取得了较好的疗效。为在探讨补肾活血方药治疗CSM疗效与血清内皮 素之间的关系，我们进行了肾骨安治疗CSM的临床与实验研究，现总结报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物选择 所选44只新西兰纯种大白免，全部为雄性( 因选择指标内皮素在雌雄性间有 较大差异，不易观察)，体重1.8～2.3kg，年龄6～12个月。
1.2 造模方法 采用北京医科大学第三附属医院蔡钦林〔1〕 的造模方法，但仅用直径3mm的AO螺钉(螺钉尾端锉钝)于C4～5椎间隙拧入，压迫一处 脊髓(蔡钦林的造模方法为以螺钉压迫兔脊髓的两处) 。 术后单笼喂养。如此2～3周后再次手术，每次拧入0.75～1mm。每只兔共行3次手术，造成 免颈髓腹侧的慢性渐进性压迫。术后1周确定术口是否感染，感染者予以剔出，末次术后1个 月开始实验。
1.3 动物分组 造模后8周，将44只兔按改良Tarlov分级进行脊髓 功能评定，各级均衡后再随机 分为中药组和空白对照组，分别饲以添加定量中药的饲料与普通饲料，于造模前、造模后8 周、用药后4周、用药后8周各点检测ET值并处死一定数量兔行颈脊髓病理光镜检查及透射电 镜观察。
1.4 观察指标 ①一般情况：发育、体重等，临床脊髓病症状(以改良Tarlov分级〔2〕法评定。0 级：肢体完全瘫痪。1级：肢体可划动。2级：关节运动良好，但不能走动和负重。3 级：可行走和负重，但不稳定。4级：正常)。②测清晨空腹静脉血ET值：从兔耳缘静脉抽取 2ml静脉血，按说明书步骤测定。选用试剂为中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所提 供 的125I-ET药盒(人ET正常值为93.67±11.80pg*ml-1)。③常规病理学检 查：观察兔颈脊髓形态学。④透射电镜观察：将动物以左心室灌注的方法处死，灌注完毕后 ，将整段颈椎快速取出，作椎板切除，将脊髓完整取出，置固定液中浸泡固定4h(4℃)，以0 .1M磷酸缓冲液清洗。然后放入1%锇酸溶液中后固定，再以0.1M磷酸缓冲液清洗。继而用不 同阶梯浓度的乙醇脱水，苯二甲酸二丙烯渗透，环氧树脂包埋，进行超薄切片，在JEM-120 0EX透射电镜下观察拍片。
1.5 给药方式 肾骨安胶囊(药物组成及比例：熟附子10g 、仙茅15g、巴戟天15g、丹参15g )。中药组饲以等量混合饲料(经加工浓缩的中药制剂与普通饲料均匀混合，制成颗粒状饲料 )，按人兔等效剂量计算〔3〕，以每天每公斤体重0.25g的剂量给药。对照组投不含 药的普通饲料。
1.6 统计学处理 用SAS软件包计算：两组间计量资料比较，用t 检验；多组间计量资料比较，用F检验。
2 结果分析
2.1 动物的一般情况 44只兔用于正式实验，造模8周后因各种原因实剩31只。按 改良Tarlov分析方法进行评定 ，1级5只，2级10只，3级16只，无0级和4级者。等级均衡后随机分为对照组16只和中药组15 只。
2.2 ET检测结果 两组造模后，ET值较造模前均明显升高( P＜0.01)；用药4周及8周后中药组ET值明显低于造模后ET值(P＜0.05)，而对照组ET值持续升高(P＜0.05)；两组间比较，造模前 及 造模后ET值无明显差别；用药4周及8周后，中药组ET值明显低于对照组(P＜0. 01)。结果如附表。
附表 两组血ET变化结果 
±s pg*ml－1
| 组 别 |
检测时间及结果 |
| 造模前 |
造模后 |
造模后4周 |
造模后8周 |
| 对照组 |
68.32±6.32 |
157.18±9.31 |
170.65±7.05 |
191.77±6.54 |
| 中药组 |
68.32±6.32 |
160.20±8.55 |
144.31±9.86 |
123.84±7.8 6 |
2.3 光镜结果 正常组灰质神经元较为饱满，呈多角形，且与周围组织结合 较为紧密；白质内髓鞘与周围 组织结合紧密，无脱髓鞘及虫蚀样空洞形成(图1)。造模后，对照组与中药组光镜下切片基 本一致，灰质内神经元损害主要在前角，以中度萎缩为主，部分可见胶质细胞增生现象；白 质损害主要在前索，组织水肿较为严重，部分有空洞变性(图2)。在用药4周后，中药组与 对照组光镜下切片与造模组相比变化不大；但在用药8周后，对照组灰质内前角运动神经元 严重萎缩，部分神经元几乎萎缩至周围组织成空洞状；白质内水肿严重，多数出现空洞样变 性 (图3)；中药组则灰质内前角运动神经元萎缩较前大为减轻，又恢复其多角形状及饱满的状 态；白质内水肿程度较轻，仅有部分小的空洞变性(图4)。
图1 正常组兔颈脊髓光镜片 ×400
图2 造模后8周兔颈脊髓光镜片 ×400
图3 空白对照组兔颈脊髓光镜片 ×200
图4 中药组用药8周免颈脊髓光镜片 ×200
2.4 电镜检查结果 由于取样及切片等技术原因，本实验仅观察到病变脊髓的白 质部分。正常组镜下可见多条 脊髓神经纤维的横切面，其中心为轴索(AX)，内有少量线粒体(Mi)，外包髓鞘(↑)，神经纤 维外偶见雪旺氏细胞(Sch)。局部放大可见髓鞘内同心排列的紧密板层结构所组成(↑)，轴 索内线粒体双层囊膜与板层排列的嵴均清晰可见(Mi)(图5)。造模组可见髓鞘变薄、扩张， 周围发生不规则的形变，并与轴索分离，两者间形成较大空白区域。部分髓鞘结构紊乱、松 散 (↑↑)(图6)。用药8周后，中药组可见髓鞘仍有一部分因扩张而呈不规则状，局部仍呈轻度 洋葱皮样改变，但髓鞘与轴索分离现象基本消失，髓鞘厚度亦恢复正常。轴索内线粒体双层 囊膜与板层排列的嵴亦清晰可见(图7)。对照组则可见髓鞘变得极薄，严重扩张，因变形而 极不规则，轴索萎缩严重，两者间形成大片空白。髓鞘结构紊乱、松散，洋葱皮样改变显著 ；轴索内线粒体肿胀明显，其双层囊膜与板层排列的嵴消失，代之以囊泡样改变(图8)。
图5 正常组兔颈脊髓电镜片 左×20000 右×4000
图6 造模组兔颈脊髓电镜片 左×15000 右×4000
图7 中药组用药8周兔颈脊髓电镜片
左×20000 右×6000
3 讨 论
3.1 脊髓型颈椎病的中医病机及本方组方依据 由于CSM的自然进程还不完全清楚，因此目前对CSM的治疗尚 缺乏统一的规范。多数学者一 般主张早期手术，但手术对什么病人、在什么时间做绝对适合尚无定论。对病情发展迅速， 有进行性神经功能损害或由于先天性椎管狭窄等引起的CSM，手术效果较佳。对大部分非手 术患者，治疗中主要以药物为主，西药主要是用皮质激素、神经营养因子等，但这些药物疗 效不能令人满意，且长期应用，副作用甚大。而中医药治疗CSM有其独特优势，疗效满意。 邓晋丰教授多年来从事骨与关节退行性变的中医药防治研究，认为“肾主骨”，肾精的盛衰 与骨骼及周围组织的生长代谢有密切关系。虽然CSM有其独特的病因病理及证状表现，临床 可以分型论治；但CSM多见于中老年人，机体的衰老与退变是其主要因素。脊髓型颈椎病辨 证为肾虚痹阻的本虚标实之证，肾之精气不足为本虚，颈项强直疼痛，转侧不利，四肢拘急 ，麻木不用为标实。且本病大多起病缓慢，病情缠绵，根据中医“久病入络”的理论，多数 患者兼有瘀阻，故临床CSM多属肾虚血瘀型，其中又以肾阳虚型较为常见。治法宜以补肾 活血为主。本方由熟附子、巴戟天、仙茅、丹参四味组成。其中熟附子大辛大热，归心脾经 ，既补命门之火，又兼逐风寒湿，为通痹之圣药；巴戟天辛温补肾阳，具有祛风除湿，强筋 壮骨之效；仙茅味辛性热，入肾经，能温肾壮阳，祛寒湿，强筋骨；丹参为血分之要药， 入心肝肾经，能破瘀通经，活血行血，内可化脏腑之瘀滞，外可通经脉而利关节，使瘀血 通而痛自除。四药相合，共奏补肾强筋，活血通络之效。
图8 对照组兔颈脊髓电镜片 左×20000 右15000
3.2 血清内皮素与脊髓型颈椎病的关系及中药对其影响 内皮素(Endothelin，ET)是迄今为止所发现的最强的内源性 缩血管肽类，主要包括ET-1 、ET-2、ET-3和血管肠收缩肽(VIC)，其中ET-1是目前已知缩血管因子中唯一强有力的缩 微血管因子，对微循环血流的调节起着重要作用。ET主要分布在血管内皮细胞、肺脏、肾脏 、肠道组织和血细胞等，但目前ET的生物学效应尚不完全清楚。近年来研究证明，ET不仅可 以作为血管内皮细胞所释放的一种激素调节心血管的活动，亦可广泛分布于神经系统，作为 一种神经递质，参与中枢神经系统的调节。放射免疫和免疫组织学及分子杂交方法，证明脑 和脊髓中有特殊性ETmRNA和ET存在〔4〕。目前已知ET在中枢神经系统中的作用主要 有：①血管调节作用；②神经调节作用。ET参与神经调节机制目前尚未阐明，已基本证实ET 作为一种神经因子参与神经调节和神经信息传递。Salzman等〔5〕研究发现中等度打 击大 白鼠脊髓损伤后，脊髓组织中ET-1水平明显增加；而鞘注ET-1的浓度越高，则脊髓损伤越 重。彭新生等〔6〕通过大鼠脊髓损伤(SCI)模型，测定SCI后伤段脊髓中ET水平，认 为脊髓损伤早期ET含量的急剧升高与脊髓损伤后早期缺血的产生有关，ET可能通过多种途径 参与脊髓损伤后的继发损伤。刘晓光等〔7〕报导CSM患者ET升高，脊髓损害严重，ET 值水平越高。他们认为ET作为一种强烈的缩血管物质，关于其在CSM中作用的研究刚刚起步 。 本研究ET检测结果显示：造模后随着造模时间的延长，脊髓损害程度越严重，ET水平越高； 而经过喂饲中药后，随着脊髓病变程度的减轻，其血ET值也逐渐下降，故ET水平值有可能反 映了CSM病变的程度(成正比关系)。目前多数学者认为脊髓血液循环障碍是引起CSM的基础， 因此ET在CSM发病的机制可能是：脊髓受到机械因素的压迫导致局部组织缺血缺氧，刺激血 管内皮细胞，通过旁分泌方式释放ET，促使脊髓局部血管痉挛，从而加重了局部脊髓缺血 、缺氧，引起组织水肿，导致脊髓受压更为严重；如此循环往复，恶性循环，最终导致局部 神经元萎缩、脱失，神经纤维脱髓鞘改变，脊髓变性，导致 肢体运动功能障碍。可见，ET作为人体内最强烈的缩血管物质，在脊髓损害过程中具有很大 影响。本研究表明，中药能降低ET值，减轻脊髓病变程度，现代药理学研究证实 ，本方中丹参可使血液流态改善，微循环血流量增加，毛细血管网开放数目增多，有利于增 加局部组织微循环的血液灌注及侧枝循环建立；熟附子则有增加冠脉流量，扩张血管及抗凝 、抗血栓作用；巴戟天及仙茅两者皆能抗炎、抗应激，增强免疫功能。因此通过服用补肾活 血中药(肾骨安)，可使病变脊髓部位的微循环血流量增加，毛细血管开放数目增多，改善 局部缺血缺氧状态，降低血ET值，从而阻断了脊髓缺血缺氧→水肿→加重压迫→脊髓缺血缺 氧的 恶性循环。而其中抗炎、抗应激、增强免疫功能等作用，则可抑制脊髓局部的炎性改变，减 轻 水肿，减轻脊髓的受压状况，而改善脊髓的病理变化。因此研究CSM中药疗效与ET的关系， 对中医认识本病的发病机制、中医诊治本病及疗效观察指标的客观化和中药治疗本病机制的 研究等都有重要意义。
3.3 脊髓型颈椎病造模方法评价 近10多年来，国外脊柱杂志(Spine)相继报道了猫和小鼠颈 髓压迫性模型的造模方法，国 内也先后报道了实验性家兔退行性颈椎病模型和实验性脊髓型颈椎病模型。上海长征医院赵 定麟〔8〕采用家兔颈椎间隙加压注射生理盐水法建立颈椎病模型；上海中医药大学 彭宝淦等〔9〕通过切除兔颈椎棘上、棘间韧带和分离椎旁两侧肌肉建立了颈椎病模 型；北京医科大学第三附属医院蔡钦林等〔1、10〕通过在兔及犬的椎体置入螺钉， 多次缓慢加压的方式，造成兔及犬脊髓的慢性渐进性压迫。以上三种造模方法比较，第3种方法的可重复性较高，效果确切，且费时较短，故本实验采 用此方法造模。从家兔颈髓切片光镜和电镜下可见：造模后8周脊髓病变较为严重；在用药4 周后，中药组病理改变较对照组及用药前为轻；在用药8周后，中药组灰质前角运动神经元 萎缩程度较前大为减轻，未见明显空洞变性及小血管异常；对照组见灰质前角运动神经元 严重萎缩，白质水肿严重，小血管充血，管周腔隙内出现淋巴细胞浸润。说明中药能明显改 善脊髓病变，本实验造模达到了预期目的。但目前CSM造模仍不理想，主要为：造模时间长 ；手术操作难度大；动物易感染，死亡率偏高。因此我们作出如下构想，以期能改进现行造 模方法：①造模方法前半部同前，直到螺钉穿透皮质后，再拧出螺钉。②以一中空的钢管( 粗细与前面所用螺钉相似但略粗)，末端套一坚韧的橡胶套。③再置入钢管，固定稳妥后， 将钢管埋于软组织内，末端另接一与钢管末端紧密连接的管道至体外。这样，当我们在体外 加压时，压力便可使末端的橡胶套膨胀，从而压迫脊髓，通过逐渐加压，我们便可便捷地得 到 脊髓型颈椎病的模型。这种造模方法，只需一次手术，不会造成因多次手术造成的感染，造 模时间可长可短，具有以前造模方法所没有的优点。此法在腰椎可成功置入，在颈椎已作 试验，并特制带槽钳，保护气囊及麻醉导管，然后丝线固定。但这仅仅是初步试验，种种细 节尚待进一步研究解决。
本课题为国家中医药管理局课题，编号：91L026
作者简介 王羽丰，男，1974年生。江苏省南京市人。1997年毕业于广州中医药大学 ，同年考取本校硕士研究生，1999年提前转博，现为广州中医药大学99 年博士研究生。曾参与省中医药管理局课题1项，国家中医药管理局课题2项，获大学科技进 步二、三等奖1次，省中医药管理局科技进步三等奖1次，已发表论文4篇。
王羽丰 现为广州中医药大学99级博士研究生。
参考文献
1，蔡钦林，黄云钟，杨文，等。慢性压迫性颈椎病超微病理变化 的实验研究。中国脊柱脊髓杂志，1996；(6)：254
2，Tarlov IM. Spinal cord compressio n. mechanism s of paralysis and treatment. pring field: Thomas，1957；147
3，苗明之。实验动物和动物实验技术。北京：中国中医药出版社 ，1997；144
4，汤健，唐朝枢。心肺内分泌学。北京：北京科学技术出版社，1 991；46
5， Salzman SK, Acosta R, Beck G, et al. Spinal endothelin content is elevated after moderate local trauma in the rat to levels associated with locomotor dysfunction after intrathecal injection. J Neurotrauma 1996；13( 2)：93
6，彭新生，陈友明，龙朝仪，等。实验性脊髓损伤后内皮素与前 列腺素含量的变化及意义。中国脊柱脊髓杂志 1998；8(4)：203
7，刘晓光，刘忠军，党耕町，等。脊髓损害中内皮素的变化。中 华骨科杂志 1996；16(7)：460
8， 赵定麟，陈德玉，沈强，等。实验性颈椎病模型的设计。中华 外科杂志 1993；31：453
9， 彭宝淦，施杞，沈培芝，等。一个新的实验性颈椎病动物模型 。中国中医骨伤科 1996；4：10
10， 蔡钦林，杨文，黄云钟，等。犬慢性压迫性颈椎病的实验研究—病理及微血 管造影的初步观察。中国脊柱脊髓杂志 1996；(5)：210
(1999-12-30收稿 2000-04-19修回)
用户登录 
新用户注册