人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 细菌学

作者：郭学青　邹全明　张卫军

单位：郭学青(原工作单位：承德二六六医院检验科)（第三军医大学临床微生物教研室）；邹全明 张卫军（第三军医大学临床微生物教研室）

关键词：螺杆菌；幽门；热休克蛋白A

　　【 摘要 】　目的　获取人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A亚单位(HspA)的DNA(hspA)，并将它克隆到质粒PinPoint^TMXa-3中进行核苷酸序列分析。 方法　利用PCR技术扩增HspA的DNA，并将其定向插入PinPoint^TMXa-3载体中通过4种荧光染料标记，激光检测的方法进行核苷酸序列分析。 结果　DNA序列分析表明，所克隆的HspA DNA序列与GenBank公布的一致。 结论　本研究获得了序列正确的HspA基因，为其重组表达及相关研究奠定了良好基础。

Clone and sequence analyse of human Helicobacter pylori

　　heat shock protein A gene

GUO Xueqing, ZOU Quanming, ZHANG Weijun. Department of Clinical Microbiology,

　　Third Military Medical University, Chongqing 400038,P.R.China

　　【 Abstract 】　Objective　To obtain DNA of human Helicobacter pylori (Hp) heat schok protein A(HspA), and the amplified fragment was inserted into the plasmid PinPoint^TMXa-3 for nucleotide sequence analysis. Methods

　　The HspA DNA was amplified by PCR and inserted into PinPoint^TMXa-3, and the sequence was analysed with the laser detection of four special marked fluorescent dyes stained products. Result　DNA sequence analysis showed the the sequence of HspA DNA was the same as that of the pulished by GenBank. Conclusion　A confirmed HspA gene has been obtained, thus a good foundation for recombinantion, expression and associated research laid.

　　【 Subject words 】　Helicobacter pylori; Heat shock protein A

　　人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活动性胃炎的病原体，亦是消化性溃疡和胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的重要致病因子。世界卫生组织已把Hp列为与胃癌发生有关的病原体^〔1〕，Hp的致病性包括它的动力、粘附力、尿素酶、磷脂酶A、热休克蛋白(Hsp)和毒素。毒素包括空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A, VacA)和细胞毒素相关A蛋白^〔2〕(Cytotoxin associated gene A protein, CagA)。新近研究表明：Hp的尿素酶B亚单位(UreB)、热休克蛋白A亚单位(HspA)和VacA均是有效的抗原成份。HspA为所有Hp共同的抗原成分。以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%试验小鼠获得保护^〔3〕。由于Hp属微需氧菌，培养条件高，难以获得大量的天然来源的HspA成分。

　　目前国内尚未见有关Hp HspA的研究报道，我们运用PCR技术克隆人Hp保护性抗原HspA基因，并构建载体对其进行序列分析，现叙述如下。

　　材料和方法

　　质粒和菌株：质粒PinPoint^TmXa-3购自Promega公司。E.coli JM109及Hp菌株系本室保存菌种。

　　培养基：(1) Hp固体培养基为本室自配；(2) LB培养基按参考文献的方法配制^〔3〕。

　　工具酶及试剂：EcoRⅤ、HindⅢ购自宝灵曼公司，T4连接酶、Taq DNA聚合酶和DNA标准分子质量λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ markers, PCR markers 购自华美公司。其它常规试剂按照《分子克隆实验指南》要求配制。

　　细菌分离纯化鉴定：自临床采尿素酶反应阳性的消化性溃疡病人的胃粘膜标本直接涂布于Hp培养基中，置5%O₂，85%N₂，10%CO₂ 37℃的条件下分离培养，培养3d后挑取可疑菌落进行形态及生化鉴定确定，革兰氏染色镜检阴性。S形或弧形，尿素酶、氧化酶、触酶试验阳性，同时做Hp的尿素酶PCR试验阳性的菌株作为Hp阳性菌株，保存于Hp液体培养液及甘油中，-80℃冻存。

　　细菌基因组DNA的制备：按《精编分子生物学实验指南》的基因组DNA小量制备法制备。

　　引物的合成：根据文献〔4〕的HspA序列设计一对特异引物，在上游引物加HindⅢ的酶切位点，下游引物加EcoRⅤ的酶切位点。为利于重组表达，在两个5′端分别设置起始密码子ATG和终止密码子TAA。为保持两引物的Tm值相似，将序列的末端几个碱基删除，为使所扩增基因的AAGCTT片段不被HindⅢ酶解，把后一个“T”突变为“G”。

　　P1: 5′-CCC AAG CTT ATG AAG TTT CAA CC-3′

　　P2: 5′-GAC GAT ATC TAA ATG ACA GCG AGC TTC-3′

　　引物由北京赛百盛公司合成，C-18纯化。

　　PCR反应体系：10×PCR扩增缓冲液10μl，4种dNTP混合液（各10mmol/L）2μl，上、下游引物（各20pmol/L）2μl，模板DNA 5μl，加水至终体积100μl。

　　目的基因的分离：反应混合物于94℃加热，变性5min加入1μl Taq DNA聚合酶（3U/μl）接着进入循环，94℃变性1min, 55℃ 1min，72℃ 1min共循环35次，再于72℃延伸5min，反应完毕后取4μl反应产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，确定后，经酚、酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，紫外定量，-20℃保存备用。

　　重组测序及表达载体的构建：载体PinPoint^TmXa-3和PCR产物均用EcoRⅤ，HindⅢ酶切，然后用低熔点琼脂糖凝胶法纯化回收DNA片段，将回收后的PinPoint^TmXa-3/EcoRⅤ+HindⅢ和PCR产物/EcoRⅤ+HindⅢ在14℃连接14～16h。PCR产物与PinPoint^TmXa-3 摩尔比为3∶1。

　　连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定：取1μl连接产物转化受体菌E.coli JM 109的感受态细胞。挑取具有氨苄青霉素(Amp)抗性的菌落于3ml含100μg/ml Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进行双酶切鉴定。

　　DNA序列分析：碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。

　　结果

　　1.HspA的扩增：PCR结果电泳分析发现在342bp左右有1条带，位于PCR markers的第5条带下方处，大小与预计相符(见图1)。

　　2.重组质粒的构建及酶切鉴定：重组质粒的构建如图2，将PCR产物经EcoRⅤ/HindⅢ双酶切后，定向插入经同样双酶切的PinPoint^TmXa-3载体中，获得的重组质粒命名为PinPoint^TmXa-3/HspA。经EcoRⅤ/HindⅢ双酶切后的重组质粒电泳，结果见图3。双酶切后产生的片段为大小约定的342bp的片段。

　　图1　琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

　　Fig 1. Identification of the PCR product by DNA agarose gel electrophoresis

　　1. PCR marker; 2. PCR product

　　图2　重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA的构建示意图

　　Fig 2. The scheme for construction of the recombinant plasmid PinPoint^TmXa-3/HspA

　　3.HspA基因片段的序列分析：把人Hp菌中扩增得到的HspA基因片段克隆至PinPoint^TmXa-3中大量抽提重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA，全自动测序仪进行序列分析，结果表明基因序列与文献报道的一致。20～361bp为所扩增片段的互补链基因序列。HspA

　　图3　重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA的双酶切鉴定图谱

　　Fig 3. Double restriction enzyme digestion map of recombinant plasmid PinPoint^TmXa-3/HspA

　　1. PCR product; 2, 3, 6, 7, 8. Positive recombinant plasmid PinPoint^TMXa-3/Hsp respectively; 4, 5. Negative recombinant plasmid respectively

　　基因编码区的核苷酸序列和氨基酸序列如下：

　　ATG AAG TTT CAA CCA TTA GGA GAA AGG GTC TTA GTA GAA

　　M　　K　　F　　Q　　P　　L　　G　　E　　R　　V　　L　　V　　E

　　AGA CTT GAA GAA GAG AAC AAA ACC AGT TCA GGC ATC ATC

　　R　　L　　E　　E　　E　　N　　K　　T　　S　　S　　G　　I　　　I

　　ATC CCT GAT AAC GCT AAA GAA AAG CCT TTA ATG GGC GTA

　　I　　P　　D　　N　　A　　K　　E　　K　　P　　L　　M　　G　　V

　　GTC AAA GCG GTT AGC CAT AAA ATC AGC GAG GGT TGC AAA

　　V　　K　　A　　V　　S　　H　　K　　I　　S　　　E　　G　　C　　K

　　TGC GTT AAA GAA GGC GAT GTG ATC GCT TTT GGA AAA TAC

　　C　　V　　K　　E　　G　　D　　V　　I　　A　　F　　G　　K　　Y

　　AAA GGT GCA GAA ATC GTT TTA GAC GGC GTT GAA TAC ATG

　　K　　G　　A　　E　　I　　V　　K　　D　　G　　V　　E　　Y　　M

　　GTG CTA GAG CTA GAA GAC ATT CTA GGT ATT GTG AGC TCA

　　V　　L　　E　　L　　E　　D　　I　　K　　G　　I　　V　　　S　　S

　　GGC TCT TGT TGT CAG ACA GAT AGT CAT GAC CAT AAA CAT

　　G　　S　　C　　C　　Q　　T　　D　　S　　H　　D　　H　　K　　H

　　GCT AAA GAG CAT GAA GCT CGC TGT CAT GAA TAA

　　A　　K　　E　　H　　E　　A　　R　　C　　H　　E　*

　　讨论

　　热休克蛋白(Hsp)是一种高度保守的蛋白质，可被多种环境应激变化如高温、炎症、放射病毒感染、恶性肿瘤转移、活性氧代谢产物、重金属、乙醇及缺氧等诱生^〔5〕。由于热休克蛋白呈现一个巨大的分子结构，其分子质量与尿素酶的天然分子质量相近。且其结构类似于尿素酶，故早期的研究中曾认为热休克蛋白是尿素酶的一个亚单位^〔6〕。Hp的Hsp基因属于双顺反子操纵子包括HspA和HspB基因，分别编码118和545个氨基酸残基，相应的相对分子质量为13.0×10³和58.2×10³。HspA包括两个区域：N区(A区)与GroES家族同源高度保守，是免疫显性区^〔7〕，C区(B区)有27个氨基酸残基，其中8个是组氨酸残基，4个是半胱氨酸残基，提示这是一个金属结合区域，和尿素酶复合体有关^〔8〕。HspA可能在镍离子转运和呈递给脱辅基酶蛋白中起作用^〔9〕。HspA与尿素酶B亚单位(UreB)一样是有效的抗原成分，可以作为基因工程疫苗的侯选分子。

　　本研究根据国外报道的人Hp基因序列，设计并合成了特异性引物P1和P2，在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码TAA及HindⅢ和EcoRⅤ限制性酶切位点，并且为了保持两引物的Tm值相似，将序列的末尾几个碱基删除，同时为使扩增基因的AAGCTT片段不被HindⅢ酶解，把后一个“T”突变为“G”。由于上述在引物设计方面的优化，使PCR反应更特异，更灵敏，并使目的基因的鉴别变得较简便，也为下一步的研究工作打下基础。

　　采用PCR技术获得了特异的Hp的HspA DNA并进行序列分析得到证实。为制备特异性核酸探针，重组表达HspA及基因工程疫苗的进一步研究奠定了重要实验基础。

　　基金项目：国家“九五”重点攻关课题(NO 96-901-01-54)；全军“九五”医药卫生科研基金资助项目

　　参考文献

　　1　International agency for research on cancer. WHO Press Release. 1994, No. 106.

　　2　EHPSG. Abstract of Ⅷth internation workshop on gastric duodenal pathology and Helicobacter pylori. Gut, 1995, 7-9th July.

　　3　Marta M. Development of a mouse model of Helicobacter pylori. Infection that mimics human disease. Science, 1995, 267, 17.

　　4　Sebastian S, Thiberge JM, Kansau I, et al. Helicobacter pylori HspA-HspB heat-shock gene cluster: nucleotide sequence, expression, putative function and immunogenicity. Mol-Microbiol, 1994, 14(5):959-974.

　　5　范学工，夏华向主编. 幽门螺杆菌感染——基础与临床. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997, 12.

　　6　Dunn BE, Roop RM, Sung CC, et al. Identification and purification of a cpn60 heat shock protein homologue from Helicobacter pylori. Infect Immun, 1992, 60:1946-1951.

　　7　Kansau I, Guillain F, Thiberge JM, et al. Nickel binding and immunological properties of the C-terminal domain of the Helicobacter pylori GroES homologue (HspA). Mol-Microbio, 1996, 22(5):1013-1023.

　　8　Wu LF. Putative nickel-binding sites of microbial proteins. Res Microbiol, 1992, 143:347-351.

　　9　Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 1997, 388:539-547.

(收稿日期：1999-04-29)