p16、Ki－67和PCNA的表达与胃肠道平滑肌肿瘤性质的关系

中国肿瘤临床 2000年第6期第27卷 论著

作者：孙威　王强　王明德　张凤祥　王东民　黄岩

单位：孙威（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003）；王强（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003）；王明德（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003）；张凤祥（辽宁省西丰县人民医院外科）；王东民（辽宁省铁岭市第二人民医院外科）；黄岩（沈阳市大东区医院外科）

关键词：胃肠肿瘤平滑肌瘤平滑肌肉瘤抑癌基因p16人抗增殖细胞核抗原Ki－67增殖细胞核抗原

　　摘要：目的：探讨p16、Ki－67和PCNA的表达与胃肠道平滑肌肿瘤（gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT）性质的关系。方法：采用免疫组织化学S－P法检测86例GISMT患者p16的表达情况,采用微波修复抗原及免疫组织化学S－P法检测人抗增殖细胞核抗原Ki－67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nucle arantigen,PCNA)来反映细胞的增殖活性。结果：p16表达按平滑肌瘤、平滑肌肉瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的顺序依次明显下降（P＜0.01)。同时，p16的表达与肿瘤的良恶性生长方式、肿瘤大小、中心有无坏死亦有明显的关系（P＜0.01或P＜0.05）。p16阳性表达组5年生存率明显高于阴性表达组（P＜0.05)。p16阴性表达组的Ki－67和PCNA表达明显高于阳性表达组(P＜0.01)。结论：p16可考虑是反映GISMT某些生物学特性的良好标志物，可以用来判断其某些生物学特性、估计预后、指导制定合理的治疗方案。p16与Ki－67、PCNA可以互补作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的参考指标。

Relationship between the Expression of p16,Ki-67,PCNA and Activity of Cell Proliferation in g-I Tract Leiomyomas

Sun Wei Wang qiang Wang Mingde et al（Department of Surgery,Second Affiliated Hospital of China Medical university,Shenyang）

　　Abstract　Objective:To study the relationship between the expression of p16,Ki-67,PCNA and the activity of cell proliferation in G-I tract leiomyomas.Methods:The p16 expression in 86 cases of G-I tract leiomyoma were determined by immunohistochemical staining S-P method and the expression of Ki-67,PCNA were evaluated by microwave retrieval antigen and immunohistochemical S-P method to reflect the cell proliferative activity.Results:The expression of p16 declined significantly according to the following order:leiomyoma,leiomyosarcomas of grade Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ(P＜0.01).Meantime,the expression of p16 was prominently delermined by the growing pattern (benign or malignant),size of the tumor,with or without central nectrosis (P＜0.01 or P＜0.05).The 5-year survival rate was significantly higher in patients with positive p16 expression than those with negative expression (P＜0.05).The Ki-67 and PCNA expression of the p16 negative group was significantly higher that of the p16 positive group(P＜0.01).Conclusion:p16 is a valuable indicator of some biological characteristics of G-I tract leiomyomas and it can be used to predict the prognosis,to guide the planning of retional therapeutic scheme.The expression of p16 and Ki-67,PCNA have reciprocity in distinguishing malignancies from the benign tumors,judging the maligmant degree,and predicting the prognosis.

　　key Words　Gastrointestinal neoplasm　Leiomyoma　Leiomyosarcoma　p16 gene　Ki-67　PCNA

　　应用免疫组织化学S－P法检测了86例胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)患者中p16的表达情况,并结合临床病理、预后指标及反映细胞增殖活性的指标:人抗增殖细胞核抗原Ki－67,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)进行综合分析,以探讨其临床病理及预后价值。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床病理资料

　　从中国医科大学第二临床学院1977年～1996年4月间手术切除的GISMT病例中选择诊断明确，病历完整者86例。其中男性49例，女性37例。年龄1～77岁，平均48.6岁。肿瘤发生于食管11例，胃30例，小肠27例，结直肠18例。根据镜下观察，选择细胞生长活跃区连续计数30个高倍视野（HPF），确定每10个HPF平均核分裂数；细胞异型性分为0～＋＋＋；细胞密度分为＋～＋＋＋。按Evans^[1]和He等^[2]的标准（核分裂数≥1个/10HPF即为恶性）来区分平滑肌瘤（leiomyoma,LM）、平滑肌肉瘤（leiomyosarcoma,LS）。LS组织学分级参考Patrick等^[3]的标准,其中LM25例；LSⅠ级（LS－Ⅰ）26例，Ⅱ级（LS－Ⅱ）20例，Ⅲ级（LS－Ⅲ）15例。根据大体病理特征LS分为：恶性生长方式组（肿瘤有周围浸润、种植或转移）40例；良性生长方式组（肿瘤无周围浸润、种植或转移）21例。肿瘤直径0.3～5.9cm组15例;≥6cm组46例。肿瘤中心有坏死组38例;无坏死组23例。本组86例GISMT中，除3例因其它原因死亡外，其余83例随访资料完整，随访时间为12～242个月，平均58个月。

　　所有标本均经10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，分别做HE染色，Ki－67采用微波修复抗原与免疫组化染色。p16,PCNA采用免疫组织化学染色。

　　1.2　主要试剂

　　鼠抗p16多抗和鼠抗Ki－67单抗(MIB－1),鼠抗PCNA单抗PC10及S－P试验盒均购自福州迈新生物制品公司。

　　1.3　染色方法

　　p16、PCNA染色均采用免疫组织化学S－P法。Ki－67染色采用微波修复抗原及免疫组织化学S－P法。

　　1.4　结果判定

　　PCNA、Ki－67结果判定:以细胞核呈棕红色或细胞核、细胞浆同时呈棕红色为阳性；单纯细胞浆着色而细胞核无着色，或细胞核，细胞浆均无着色为阴性，于40倍光镜下10个视野计数，每个视野计数100个细胞，则标记值:为阳性细胞总和/1000×100％。

　　p16结果判定：以细胞浆呈清晰红色为阳性判定标准。根据着色浓度分为：强阳性＋＋＋，呈深红色；弱阳性＋，呈淡红色；界于两者之间＋＋；以细胞不着色或与背景一致为阴性（－）。

　　对照：同已知阳性片对照。

　　1.5　数据处理

　　采用χ²检验、t检验。患者生存率分析采用Kaplan－Meire寿命表法及Log－rank检验。

　　2　结果

　　2.1　p16表达与GISMT临床病理特征的关系

　　随着GISMT良恶的改变及恶性程度的增高，p16表达率依次明显递减（P＜0.05）。另外，LS中p16阳性表达率与肿瘤良恶性生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显的关系。详见附表。

附表p16表达与GISMT临床病理特征的关系

　　2.2　p16表达与GISMT患者预后的关系

　　p16表达阳性组5年生存率为70.48％；阴性组5年生存率为36.25％。两组间存在显著性差异（P＜0.05)。

　　2.3　p16表达与Ki－67、PCNA表达之间的关系(x±s)

　　p16阳性表达的Ki－67标记值为3.25±2.47，阴性表达组Ki－67标记值为7.47±3.05,两组间差异有极显著意义(P＜0.01)。p16阳性表达的PCNA标记值为11.11±6.22，阴性表达组PCNA标记值为21.92±9.01,两组间差异有极显著意义 (P＜0.01)。

　　3　讨论

　　p16基因是位于人9号染色体的P21区域。Roe等^[4]在研究细胞周期时发现，细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(cdks,cyclin)的活化，cdks只有与周期蛋白结合才被激活。今发现p16可直接作用于cdk4，cyclinD和P110RB的反馈回路，通过调节P110RB蛋白活性防止细胞增殖，故称依赖性细胞周期蛋白激酶（cdk4)抑制剂。

　　p16基因突变在人恶性肿瘤中相当普遍^[5]。本研究结果显示：GISMT中从LM到LSⅠ、Ⅱ、Ⅲ，随着组织分级的升高，阳性表达率依次下降（P＜0.05）。在LS中较大肿瘤、中心有坏死、恶性生长方式组中p16表达率明显低于相应对照组。因而说明p16基因在GISMT的增殖、分化及复发、转移过程中起着重要的负性调控作用。随访结果提示p16阳性表达组的5年生存率较阴性表达组高（P＜0.05)。说明检测p16在GISMT中的表达情况，有助于进一步了解GISMT的生物学行为，并可作为判断预后的一项指标。

　　Ki－67是由Gerdes等^[6]于1983年首次制备成功，它存在于增殖细胞当中，在静止细胞则不表达。微波修复抗原方法的出现^[7]，使Ki－67的应用范围明显扩大了。PCNA是36KD的核蛋白,是DNA多聚酶的一种辅助蛋白。PCNA在G0细胞中含量很少,G₁晚期开始增加,S期达到高峰,G₂期和M期开始下降,是评价细胞增殖状态的重要指标。在多种肿瘤的研究中,人们发现PCNA表达与肿瘤的生物学特性、预后有良好的相关性。

　　目前认为Ki－67、PCNA均是反映增生活性的单抗，而p16则是最近发现的一种新型抑癌基因；Ki－67、PCNA均是反映增殖的直接指标，而p16则是一种间接的指标。本研究发现该两种指标在随着恶性程度的升高的同时，它们的表达呈相反趋势。在p16表达阳性与阴性组的Ki－67,PCNA表达均有显著差异（P＜0.01）。p16的缺失使其对细胞增殖的负性调控作用下降或消失，细胞增殖过度，表现为Ki－67、PCNA表达的明显升高。因此有理由认为Ki－67、PCNA高表达而p16阴性表达的GISMT恶性程度很高，预后非常差。

(李梦兰 校对)

　　本文课题受辽宁省自然科学基金资助(课题号:972254)

　　参 考 文 献

　　1，Evans HL.Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract:a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years.Cancer,1985,56:2242～50

　　2，He LJ,Wang BS,Chen CC.Smooth muscle tumors of the digestive tract:Report of160 cases.Br J Surg,1988,75:184～6

　　3，Patrick CM,James PN,Walter L,et al.Gastrointestinal Sarcomas:Analysis of prognostic factors.Ann Surg,1987;2060:706～10

　　4，Roe JL ,Rivin CJ ,Sessions RA,et al.The tousled gene in A.Thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development.Cell,1993,75:939～50

　　5，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436～40

　　6，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of A mouse monocolonal antibody reactive with a human nuclear antigen associate with cell proliferation.Int.J.Cancer,1983,31:13～20

　　7，Shi SR ,Key ME ,Kalra KL.Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues:An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.J histochemistry and cytochemistry,1991,6:41～48

1999－06－25收稿

　　1999－11－26修回