胃肠道恶性肿瘤P16基因纯合性缺失的检测

　　中华检验医学杂志2000年第23卷第5期

马晋平　詹文华　许多荣　彭俊生　郑章清　蔡世荣　何裕隆　汪建平

　　摘　要　目的　用半定量多重聚合酶链反应(PCR)法探讨胃肠道恶性肿瘤P16基因纯合性缺失的意义。方法　收集31例患者手术切除的胃肠道原发恶性肿瘤组织标本，其中胃癌18份，结肠癌13份。采用半定量多重PCR检测其P16基因的纯合缺失情况。结果　在31份胃肠道原发恶性肿瘤组织标本中，9份为P16基因纯合缺失,6份胃癌的 p16基因纯合缺失中，4份是低分化腺癌，2份是未分化癌；3份结肠癌P16基因纯合缺失者为低分化腺癌。结论　P16基因异常对阐明胃肠道恶性肿瘤的生物学行为有一定的意义。半定量多重PCR方法稳定、简便，值得推广。

　　关键词：胃肠肿瘤；基因，结构，肿瘤；聚合酶链反应

　　P16基因是1994年由Kamb等^［1］首先发现，其位于人第9号染色体短臂（9p21）上，由3个外显子（126bp,307bp,11bp）和2个内含子组成。P16基因编码蛋白是细胞周期素D及其依赖性激酶(CDK)4的特异性抑制剂，通过抑制细胞周期进程而抑制细胞增殖。P16基因在多种肿瘤中有高频率的纯合缺失和点突变，使之成为继P53之后肿瘤基础及临床研究中又一热点之一^［2］。我们应用半定量多重聚合酶链反应(PCR)法检测了31份胃肠道恶性肿瘤组织中P16基因的纯合缺失情况，旨在探讨本法的可行性和P16基因在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的意义。

　　材料和方法

　　1.标本：31份胃肠道恶性肿瘤包括我院腹部外科从18例胃癌和13例结肠癌患者手术切除的肿瘤组织。标本经常规必要处理后，放入-80℃低温冰箱储存待用。所有标本均经术后病理证实。

　　2.半定量多重PCR扩增：选P16基因纯合缺失K562细胞株作为阳性对照。选择凝血因子Ⅸ因子外显子4为内对照。将P16基因外显子1或2引物和血友病Ⅸ因子基因外显子4引物放在一个体系中进行多重PCR扩增。反应体系包括10×缓冲液5.0μl，MgCl₂ 3.0 μl，三磷酸脱氧核苷4.0 μl，Taq酶1.5 U，DNA200 ng，引物P16 外显子1（引物：5′-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3′、5′-GCGCTACCTGAT-TCCAATTC-3′），外显子2（引物：5′-GCTCTACACA-AGCTTCCTTTCC-3′、5′-ACGAATTCTCAGATCATCAGT-CC-3′）和乙型血友病Ⅸ因子基因外显子4（引物：5′-CCAATGAGTATCTACAGGGG-3′、5′-TACACCAATATT-GCATTTTC-3′）。反应条件：首先97℃变性8 min，外显子 1+外显子4 94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min；外显子2+外显子494℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1.5 min；上述最后一个循环在72℃继续反应6 min。共35个循环。PCR产物进行含溴化乙啶(EB)的2%琼脂糖电泳。紫外光下观察结果并照相。负片经热化学发光(TCL)扫描仪扫描，测定产物带的吸光度值。

　　3.半定量结果判定：正常人的PCR扩增结果应为长度273 bp的凝血因子Ⅸ因子基因外显子4的扩增产物和长度336 bp（P16 基因外显子1产物）或393 bp（P16 基因外显子2产物）。其比值以A₁/A₄或A₂/A₄表示（A₁、A₂和A₄分别表示P16基因外显子1，2和凝血因子Ⅸ因子基因外显子4扩增产物的吸光度值）。以3倍K562细胞DNA和1倍正常人细胞DNA多次混合扩增的比值的平均值作为P16基因纯合缺失的标准值^［3］，本研究测得的平均值分别为A₁/A₄：1.1716±0.091 3；A₂/A₄：1.168 0±0.084。如果试验标本的测定值小于上述标准平均值，则认为该标本属P16基因外显子1或2纯合缺失。

　　结果

　　31份胃肠道原发恶性肿瘤组织标本中，检测到9份为P16基因的纯合缺失：18份胃癌标本中检测到6份为P16纯合缺失，分别是低分化腺癌4份，未分化癌2份；其余的12份标本的组织学类型包括高分化腺癌4份、中分化腺癌1份、低分化腺癌1份、印戒细胞癌3份、粘液癌1份和未分化癌2份。13份结肠癌标本中3份检测到P16纯合缺失，均为低分化腺癌，其余10份标本的组织学类型分别为高分化腺癌1份、中分化腺癌7份、低分化腺癌和未低分化腺癌各1份。

　　讨论

　　P16基因抑制肿瘤的机制主要通过P16蛋白与细胞周期素D竞争性结合依赖性激酶，直接抑制细胞周期素依赖性激酶复合体的形成，从而抑制Rb蛋白(抑癌基因)的磷酸化。P16基因的异常与多种人类肿瘤的发生发展相关^［4］。P16基因纯合缺失在胃肠道恶性肿瘤中的检出情况，目前的报道颇不一致。Hayashi等^［5］检测了36例原发胃癌和9个胃癌细胞系中P16基因，其中有2个细胞系检测到P16基因纯合缺失，而原发肿瘤中无1例检测到P16基因纯合缺失。Takaoka等^［6］报道了23份手术获得的原发胃癌组织标本均未检测到P16基因外显子1或外显子2缺失。钱立平等^［7］报道，在32份胃癌手术标本中11份（33.4%）显示P16基因缺失。结合其他的研究资料，除食管癌和胰腺癌外^［8］，P16基因在人类其他肿瘤中的点突变率均很低。我们在31份胃肠道原发恶性肿瘤组织中，检测到9例P16基因的纯合缺失，总检出率为29.0%。说明P16基因缺失可能与胃肠道恶性肿瘤的发生、发展有一定相关。本研究的结果显示，胃肠道肿瘤的分化程度可能与P16基因异常缺失有关，但由于检测的样本量较小，确切的相关性研究尚待进一步探讨。

　　我们用P16基因纯合缺失的K562细胞株作标准对照，设计内对照引物，与P16基因扩增引物同时扩增，用系列稀释法作PCR半定量分析，比较2条扩增产物带的吸光度A值，再与标准对照相比，可发现P16基因纯合缺失。用凝血因子Ⅸ因子基因外显子4作内对照，其在正常人的变异率很低，扩增片段长度为273 bp。将P16基因外显子1或2引物和血友病Ⅸ因子基因外显子4引物放在一个体系行多重PCR扩增。正常人应出现2条带，即273 bp和393 bp，或是273 bp和336 bp，如果未观察到336 bp或393 bp，则可认为P16基因外显子1引物或外显子2缺失，如果也无273 bp带，则扩增失败。

　　临床肿瘤标本很可能混有少量正常细胞，为了排除假阴性，选用P16基因纯合缺失的K562细胞株作标准对照。将3倍K562 细胞DNA与1倍正常人细胞DNA混合进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳、伊文思蓝染色，薄层扫描，最后比较并计算2条扩增产物带吸光度A值的比值，再和正常标准进行比较，小于此值则可认为P16基因纯合缺失。通过对31份胃肠道恶性肿瘤P16基因纯合缺失的检测，本法具有快速、简便和耗费低的特点，便于临床推广应用。

　　基金项目：中山医科大学211工程重点学科建设项目(98097)

　　作者单位：马晋平（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　詹文华（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　彭俊生（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　郑章清（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　蔡世荣（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　何裕隆（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　汪建平（510080广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科)

　　许多荣（510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科）

　　参考文献

　　1，Kamb A, Gruis NA, feldhaus JW, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genes of many tumor types. Science, 1994, 264:436-440.

　　2，Marx J. New tumor suppressor may rival P53. Science, 1994, 264:344-345.

　　3，Sill H, Goldman JM, Cross NC, et al. Homozygous deletions of P16 tumor-suppressor gene are associated with lymphoid transformation of chronic myeloid leukemia. Blood, 1995,85:2013-2016.

　　4，Cairns P, Polascik TJ, Eby Y, et al. Frequency of homozygous deletion at p16/CDKN2 in primary human tumors. Nat Genet, 1995,11: 210-212.

　　5，Hayashi K，Metzger R，Salonga D，et al. High frequency of simultaneous loss of p16 and p16 beta gene expression in squamous cell carcinoma of the esophagus but not in adenocarcinoma of the esophagus or stomach. Oncogene, 1997,15: 1481-1488.

　　6，Takaoka AS, Kakiuchi H, Itoh FSO, et al. Infrequent alterations of the p16 (MTS-1) gene in human gastric cancer. Tumour Biol, 1997, 18: 95-103.

　　7，钱立平，林庚金. 人胃癌组织MTS1基因缺失的研究.中华消化杂志, 1999, 19: 38-41.

　　8，Caldas C, Hahn SA, de Costa LT, et al. Frequent somatic mutation and homozygous deletions of the P16(MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma. Nat gent,1994,8:27-32.