幽门螺杆菌对体外培养胃粘膜组织的损伤作用

　　福建医科大学学报2000年第34卷第1期

周琳瑛　梁平　钟秀容　佘菲菲　陈莲云

　　摘　要:目的　在排除了炎症及免疫反应的条件下，探讨幽门螺杆菌(Hp)本身因素对胃粘液细胞的损伤作用。方法　将胚胎胃粘膜组织与Hp共培养2,4,6 h后，利用光镜及电镜对胃粘膜组织进行形态学观察。结果　光镜观察粘液细胞水肿且凋亡增加，电镜观察除见有凋亡细胞、凋亡小体外，粘液细胞还出现微绒毛丢失、粘液颗粒减少、细胞内出现多少不等的空泡等改变。上述变化随着胃粘液细胞与Hp共培养时间的延长而加重。在共培养6 h后，少部分粘液细胞发生坏死。结论　Hp本身即可引起粘液细胞变性、坏死，加速粘液细胞凋亡。

　　关键词:幽门螺杆菌　胃粘膜　细胞凋亡

　　现已公认，幽门螺杆菌(Hp)相关性疾病是由多种因素综合作用的结果，其中包括Hp本身的因素如机械作用、毒素、代谢产物以及炎症反应和局部免疫反应过程中炎症细胞等释放的炎症介质和细胞因子等。但此二类因素经常同时存在并相互影响，致使Hp相关疾病的发病机制变得复杂难解。为了化繁为简，本文利用胚胎胃粘膜组织原代培养,观察Hp对粘液细胞凋亡、变性及坏死等的损伤作用，旨在排除炎症及免疫反应的条件下，探讨Hp本身因素在胃炎及胃癌发生和发展中的致病作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　Hp培养

　　Hp分离自胃溃疡患者的活检胃粘膜组织中，培养基采用空肠弯曲菌选择性琼脂培养基，补充5%羊血、1 mg/100 ml万古霉素、250 IU/100ml多粘菌素、0.5 mg/100 ml TMP，37℃微需氧环境(5%O₂，10%CO₂)培养3天后细菌长满培养皿。培养后经生化学鉴定，显示尿素酶及过氧化酶试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，证实所培养为Hp并收集于无菌小瓶中，经比浊法调节Hp浓度为10⁸CFU/ml。

　　1.2　胃粘膜组织原代培养

　　5个月以上胎龄的胚胎5例，水囊引产后2 h以内取胃窦部粘膜(约1 mm×1 mm×1 mm)，采用组织块培养法，培养基为RPMI 1640含15%灭活小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，pH 7.2～7.4，置5%CO₂、100%湿度、37℃ CO₂培养箱中静置培养。

　　1.3　Hp与胃粘膜组织共培养

　　取培养24 h的胃粘膜，吸去胃粘膜组织培养瓶中原有的培养液，经不含有青霉素及链霉素的培养液轻轻漂洗后，加入含有Hp的培养液3 ml/瓶，分别共培养2,4和6 h后收集标本进行形态学观察，并取不加Hp的相同培养时间的胃粘膜组织为对照组。

　　1.4　形态学观察

　　(1)石蜡包埋后，切片分别HE染色及甲基绿-派洛宁染色^［1］,光镜观察;(2)标本经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定4 h以上，0.1 mol/L PBS漂洗后逐级乙醇-丙酮脱水，Epon618浸透，包埋，超薄切片经铅、铀双染，EM208透射电镜(荷兰菲利普公司)观察。

　　2　结　果

　　未加Hp的对照组　各时间段HE染色见上皮细胞层完整，粘液细胞呈柱状，浆红染，粘液颗粒位于细胞上端，无丢失，核位于细胞基底部。电镜见绝大多数区域细胞结构保存完好，细胞浆内线粒体、内质网、高尔基体和粘液颗粒等结构清晰，核膜完整，核内染色质分布正常，部分细胞可见核仁，细胞间连接完好(图1)，仅个别细胞胞浆内次级溶酶体稍增多，线粒体略肿胀。光、电镜观察凋亡的细胞极少见。

　　与Hp共培养组　共培养2 h以后，胃粘膜组织轻度水肿，见少量凋亡细胞脱于腺腔中，其细胞核固缩，体积缩小而胞浆红染，经甲基绿-派洛宁染色见这些固缩细胞核呈绿蓝色，胞浆呈红紫色而将其与环死细胞相鉴别；其培养4h以后，部分粘液细胞粘液颗粒减少，凋亡的粘液细胞增多明显，多数已脱落至腺腔中，少数仍位于粘膜上皮内，核固缩或呈半月状；其培养6h后，凋亡细胞更多，几乎每个腺体中均可见到。电镜见不同时间段均有多少不等的Hp粘附于粘液细胞的表面(图2)，未见浸润粘液细胞内。共培养2h后，细胞间隙扩大，部分粘液细胞微绒毛丢失，粘液细胞含大小不等的空泡(图3)，胞浆内次级溶酶体增多；4h后，部分粘液细胞粘液颗粒减少甚至完全丢失，部分粘液颗粒则相互融合成均匀一片，以上这些变化随着Hp与胃粘膜组织共培养时间的延长而加重。在共培养4h及6h的超薄切片中可见不同时期的凋亡粘液细胞，表层粘液细胞及腺上皮细胞均可发生。早期凋亡细胞的细胞及核无明显缩小，仅见核染色质边集，晚期整个细胞核固缩呈致密状或核染色质固缩成致密的块状，与细胞膜间存在有较大的空隙(图4)，大部分凋亡的细胞位于上皮细胞游离面或腔内，少数凋亡小体可被邻近的粘液细胞吞噬(图5)。此外，共培养6h后 ，还可见少部分坏死的粘液细胞，细胞内线粒体、粗面内质网等肿胀，细胞膜及核膜不完整。

1　未加Hp组，粘液细胞层结构正常　×3600

2　Hp粘附于粘液细胞表面　×9000

3　粘液细胞内有大小不等的空泡　×10000

4　凋亡的粘液细胞脱落于腺腔中　×8000

5　凋亡小体被邻近细胞吞噬　×10000

　　3　讨　论

　　随着对Hp致病性的深入研究，发现Hp与胃癌的发生有较密切的关系，其机制仍不清楚。近年来，对细胞凋亡与肿瘤发生的关系进一步明确，已有一些学者注意到在Hp感染的胃粘膜活检标本中，粘液细胞的凋亡及增殖加速^[2,3]，但是在体内促进细胞凋亡的原因有多种，并不说明Hp与粘液细胞加速凋亡之间存在必然联系。本研究利用体外组织培养技术，将Hp与胚胎胃粘膜组织共培养，在排除了机体炎症反应及免疫反应时各类炎症介质、细胞因子的作用后，应用光镜及电镜证实了Hp本身因素即可加速粘液细胞的凋亡。细胞凋亡时，胞质内常有mRNA表达增强，而坏死时胞质内常有RNA的损失，试剂甲基绿对DNA着色，派洛宁对RNA有亲和性，根据这一特点使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着色，如果细胞质内核糖核酸呈派洛宁阳性染色者则为凋亡细胞，呈阴性染色者则为坏死细胞，因此甲基绿-派洛宁染色可将凋亡细胞与坏死细胞区分开来^［1］。

　　对Hp加速粘液细胞凋亡机制的研究已取得初步的进展。Shirin等^［4］初步研究发现Hp可以使p27kipl上调，从而阻止细胞从G₁期进入S期而发生凋亡。此外，一些体内、外实验中均发现Hp可使组织中NO合成加速^［5］，而NO可使细胞DNA链断裂^［6］，就有可能使p53聚集，激活周期素依赖激酶抑制物p21waf1/cip，这也可能是Hp加速粘液细胞凋亡的机制之一。粘液细胞凋亡加速可能引起胃粘膜腺体的萎缩^［7］，而与萎缩性胃炎的发生有关；粘液细胞凋亡与增殖的异常亦可能与胃癌的发生有关；此外，还有研究发现内皮素引起胃溃疡亦与其加速粘液细胞凋亡有关^［8］。

　　本实验还发现Hp与胃粘膜组织共培养后，粘液细胞可发生一系列形态学改变，包括微绒毛减少，粘液细胞内粘液减少或粘液融合，以及粘液细胞空泡变性等，与Hp相关性胃炎活检胃粘膜组织观察结果相一致，说明在此类病变的形成中Hp仍起主导作用。其中，空泡变性被认为是Hp引起的较为特异性的一种变化，是由空泡毒素(VacA)引起的。VacA是一种87 kDa蛋白质，由136 kDa分子前体水解而成，对热不敏感，可被酸性蛋白中和。编码VacA的基因存在于所有Hp菌株中，但仅有60%的菌株表达VacA，其中胃溃疡患者胃粘膜中Hp的VacA表达率较胃炎者高。VacA引起细胞空泡变性的机制仍不是很清楚，Ricci^［9］认为细胞吞饮毒素后形成内吞泡，且毒素又影响正常细胞内吞泡的结构和/或干扰其与溶酶体及高尔基复合体trans面的循环转化，以致内吞泡相互融合，形成大的空泡。也有人认为毒素是通过影响Ⅴ型ATP酶和（或）改变细胞间膜通道而起作用的^［10］。目前有人认为细胞程序性死亡的形式，除了凋亡之外，还包括细胞自噬性死亡(autophagic cell death)，以细胞内空泡形成为其特点^［8］。Hp引起细胞内空泡增多，是否属这种细胞自噬性死亡有待进一步探讨。

　　作者简介:周琳瑛,女，1969年6月生，助理研究员,医学硕士.

　　作者单位：周琳瑛(福建医科大学电子显微镜室,福州 350004)

　　梁平(福建医科大学电子显微镜室,福州 350004)

　　钟秀容(福建医科大学电子显微镜室,福州 350004)

　　佘菲菲(福建医科大学微生物学教研室,福州 350004)

　　陈莲云(福建医科大学电子显微镜室,福州 350004)

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