哮喘患者T_H亚群的失衡及与相关细胞因子、肺通气功能改变的相关性研究

　　中华结核和呼吸杂志2000年第23卷第3期

王群　林江涛　孙洪涛　叶丽亚　李静　赵武述

　　 摘要　目的：分析哮喘患者辅助性T淋巴细胞亚群(T_H亚群)平衡的变化及与相关细胞因子、血清总IgE、外周血嗜酸细胞及肺通气功能的相关关系。方法：采用酶联免疫斑点法测定20例哮喘患者外周血T_H亚群、PBMC培养上清白细胞介素4（IL-4）和γ干扰素（IFN-γ）含量、血清总IgE、外周血嗜酸细胞计数及肺通气功能，并与10名健康正常者的结果进行比较。结果：正常对照组T_H2/T_H1比值（0.40±0.20）与急性发作期组（2.90±2.30）及稳定期组（0.90±0.50）比较，差异有显著性(P＜0.05)，急性发作期组与稳定期组比较，差异也有显著性(P＜0.01)。T_H1亚群与IFN-γ水平呈显著正相关(r=0.67,P＜0.01)，T_H2亚群与IL-4水平呈显著正相关(r=0.66,P＜0.01)。IgE与IL-4水平呈显著正相关(r=0.69,P＜0.01)。一秒钟用力呼气容积（FEV₁）与T_H1亚群呈显著正相关(r=0.54,P＜0.05)，与T_H2亚群或T_H2/T_H1比值呈显著负相关(r分别=-0.61、-0.69, p均＜0.01)。血清总IgE及嗜酸细胞计数与T_H2亚群呈显著正相关(r分别=0.96、0.65,P均＜0.01)。结论：哮喘患者存在着T_H亚群比例失衡，这可能是哮喘发病的重要机制,T_H亚群比例失衡的情况与哮喘的病情程度有一定关系。

　　 关键词：气管哮喘　细胞因子　嗜酸细胞　T_H亚群

　　支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病，涉及T淋巴细胞、嗜酸细胞、肥大细胞和中性粒细胞等，但何种细胞为始动细胞，目前尚存争议。研究发现，辅助性T淋巴细胞亚群（T_H亚群）按产生细胞因子的类型和生物学功能的不同,可以分为T_H1和T_H2两种类型,它们通过所分泌的细胞因子相互调节,以维持机体免疫功能的平衡^［1，2］。当T_H2亚群占优势时，易发生高IgE血症和嗜酸细胞增多症，因此T_H亚群比例失衡可能是哮喘发病中的一个重要环节或始动因素。我们以急性发作期及稳定期哮喘患者为研究对象，旨在探讨T_H亚群失衡与哮喘发病的关系。

　　对象与方法

　　一、对象

　　1.急性发作期组：根据1997年4月中华医学会呼吸病学分会制定的“支气管哮喘防治指南”，选择符合哮喘诊断标准的急性发作期患者20例。男11例，女9例，平均年龄(45±19)岁。

　　2.稳定期组：指急性发作期组患者喘息缓解，体格检查双肺哮鸣音消失2周后。共20例,资料同急性发作组。

　　3.正常对照组：健康正常者10名，男6名，女4名，平均年龄(41±13)岁。既往无哮喘病史及过敏性疾病史，近3个月内无急性呼吸道感染，体格检查正常。

　　二、方法

　　1.T_H亚群分类测定方法: 取外周血5 ml加入淋巴细胞分离液（Ficoll）中，分离PBMC，生理盐水洗2次后显微镜下计数。取2×10⁶个细胞，放于培养瓶中，加入伊诺霉素(inomycin，75μg/ml)、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸（PMA，500 ng/ml) 、monensin (100 μg/ml)及1640培养液至1 ml，放于37℃、5％ CO₂孵育箱中活化刺激5小时。取2×10⁶个细胞放于培养板中，加入伊诺霉素、PMA及1640培养液至1 ml，放于37℃、5％ CO₂孵育箱活化刺激24小时后收取上清液贮藏于-20℃冰箱中，用于测定干扰素（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）等指标。收集培养细胞，涂片、固定、通透、封闭后每片加小鼠抗人IFN-γ单抗(12.5μg/ml)或IL-4单抗(6.25 μg/ml)，对照采用同等量PBS液放于湿盒中，4℃下反应过夜，次日PBS液充分冲洗，加生物素标记的羊抗鼠II抗反应40分钟，冲洗后加链卵白素碱性磷酸酶复合物反应40分钟，冲洗后以奈酚磷酸盐缓冲液-坚固红溶液显色，苏木精复染，明胶封片。结果判定：在油镜下，阳性细胞胞浆内有成片大小不等的不规则条块或大颗粒状红色染斑，阴性细胞胞浆内无色,计数400个细胞，计算阳性细胞的百分比。

　　2.血清IgE含量、PBMC培养上清IL-4、IFN-γ含量测定：均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法（比利时Medgenix公司试剂盒）。肺通气功能测定仪采用日本Chest公司的 autospiro HI-498型肺功能仪，测定一秒钟用力呼气容积(FEV₁)等指标。外周血嗜酸细胞计数采用瑞氏染色，按照形态学标准进行细胞分类。

　　三、统计学处理

　　组间分析采用t检验，两因素之间的相关性分析，采用直线相关分析。

　　结果

　　一、哮喘患者T_H亚群平衡的改变

　　1.T_H1亚群：急性发作期组明显低于稳定期组及正常对照组，稳定期组亦明显低于正常对照组，三组之间差异均有显著性(P＜0.01)。

　　2.T_H2亚群及T_H2/T_H1比值：急性发作期组明显高于稳定期组及正常对照组，稳定期组亦明显高于正常对照组，三组之间差异均有显著性(P＜0.01，表1)。

　　二、PBMC培养上清IL-4、IFN-γ测定结果

　　1.PBMC培养上清中IFN-γ水平:急性发作期组明显低于稳定期组及正常对照组，稳定期组亦明显低于正常对照组，三组之间差异均有显著性(P＜0.01)。

　　2.PBMC培养上清中IL-4水平：急性发作期组明显高于稳定期组及正常对照组，稳定期组亦明显高于正常对照组，三组之间差异均具有显著性(P＜0.01)。

　　三、血清总IgE测定及外周血嗜酸细胞计数

　　哮喘患者血清总IgE及外周血嗜酸细胞计数明显高于正常对照组,并且急性发作期组患者明显高于稳定期组,三组之间差异均有显著性(P＜0.01)。

　　四、T_H亚群与IL-4、IFN-γ、IgE、EOS、FEV₁的相关性分析

　　1.T_H亚群与肺通气功能相关关系: T_H1亚群与FEV₁呈显著正相关（r=0.54，P＜0.05），T_H2亚群与FEV₁呈显著负相关（r=-0.61，P＜0.01）,T_H2/T_H1比值与FEV₁呈显著负相关（r=-0.69，P＜0.01）。

　　2.T_H亚群与PBMC培养上清 IL-4、IFN-γ的相关关系：急性发作期组T_H2与IL-4水平呈显著正相关（r=0.66，P＜0.01）；T_H1与IFN-γ水平呈显著正相关（r=0.67，P＜0.01）。

　　3.T_H亚群与血清总IgE、外周血嗜酸细胞计数的相关关系：T_H2与IgE水平之间存在显著正相关（r=0.96，P＜0.01）,IgE与IL-4之间存在显著正相关（r=0.69，P＜0.01），T_H2亚群与外周血嗜酸细胞计数呈显著正相关（r=0.65，P＜0.01）。

表1　三组患者T_H亚群及PBMC培养上清IL-4、IFN-γ、血清总IgE、EOS计数结果（x±s）

　　 注：与对照组比较^*P＜0.01；与急性发作期组比较^#P＜0.01讨论

　　一、T_H 亚群在哮喘发病中的作用

　　1986年Mosmann 等^［1］发现小鼠的CD⁺₄ t细胞株按产生细胞因子的类型和生物学功能，可分为T_H1和T_H2两种类型。1991年Maggi等^［2］发现，人类也有类似小鼠的T_H1和T_H2亚群。当 t_H2 亚群占优势时，易发生高IgE血症和嗜酸细胞增多，因此推测T_H1和T_H2之间的平衡对哮喘的发病必然起着很重要的作用。

　　我们发现当哮喘呈急性发作的临床表现时，患者的肺通气功能指标FEV₁下降明显，此时T_H亚群失衡也最明显，以至T_H2/T_H1比值明显升高；当哮喘的临床表现处于稳定状态时，肺通气功能指标好转，T_H亚群比例失衡亦恢复好转。T_H2亚群与FEV₁之间呈显著负相关，T_H1亚群与FEV₁呈显著正相关，表明T_H亚群的极性偏离，即T_H2亚群数目增多和功能亢进，T_H1亚群数目减少和功能低下，可能是哮喘发病的重要机制。

　　二、IL-4、IFN-γ与T_H亚群的关系

　　Ying等^［3］利用免疫组化和原位杂交技术对过敏性哮喘患者BALF和气道活组织中的IL-4、IL-5 mRNA表达阳性细胞表型进行分析，发现70％以上的IL-4、IL-5 mRNA表达阳性细胞为激活的T淋巴细胞，其余为肥大细胞和嗜酸细胞。结合本组研究中T_H1亚群与PBMC培养上清IFN-γ呈正相关、T_H2亚群与PBMC培养上清IL-4呈正相关的结果，认为IL-4主要由T_H2细胞分泌，IFN-γ主要由T_H1细胞分泌。在哮喘发作期，T_H2亚群数目增多，激活的T_H2亚群释放高水平的IL-4、IL-5等细胞因子，相反IFN-γ等T_H1类细胞因子分泌水平则降低，因此T_H亚群对哮喘的影响是通过其分泌的细胞因子实现的。通过给与T_H1类细胞因子或减弱T_H2类细胞因子的表达和功能，来恢复T_H1与T_H2类两类细胞因子之间的比例失衡是哮喘治疗的新途径。哮喘的细胞因子疗法近年来也受到广泛的关注^［4，5］。

　　三、IL-4在哮喘发病中的作用及与IgE的关系

　　研究已经证实，IL-4在促进B淋巴细胞合成IgE的过程中具有关键性的作用^［6，7］。本组研究发现，IL-4与IgE之间存在着显著正相关，提示IL-4等产生增加是导致血清IgE水平增加的重要原因，而IL-4等细胞因子的产生增加亦直接来源于T_H2/T_H1亚群平衡的变化。

　　四、T_H亚群与嗜酸细胞

　　嗜酸细胞的激活与气道高反应性的发生具有重要的关系^［8］。 busse等^［9］的研究证实，IL-5 mRNA的表达与哮喘的严重程度和末梢血嗜酸细胞的计数相关，与嗜酸细胞阳离子蛋白水平相关。本组研究发现，T_H2亚群与嗜酸细胞之间呈显著正相关，间接证实哮喘患者由于T_H2亚群功能亢进，使分泌的IL-5水平增高，引起嗜酸细胞趋化、增殖、活化，故外周血中嗜酸细胞的水平增高。提示T_H2亚群数目增多是此反应的始动因素。

　　我们的研究还发现，一个必须引起注意的问题，哮喘患者虽然处于稳定期，临床症状、体征消失，但T_H亚群平衡失调仍然存在，T_H2类细胞因子的水平虽然低于急性发作期，但仍然高于正常人水平，这可能是哮喘反复发作、难以治愈的原因，提示临床医生应重视和坚持缓解期的治疗。

　　五、关于T_H亚群测定的方法学问题

　　本组研究采用的T_H亚群测定方法，是利用胞浆内细胞因子的染色技术，在单个细胞的水平上检测细胞因子分泌细胞出现的频率^［10］。在单个细胞的水平上检测细胞因子的分泌情况更有利于研究细胞与细胞因子之间的关系。T_H亚群不仅可在CD⁺₄ t细胞中发现，而且近年发现CD⁺₈ T细胞中按照分泌细胞因子的情况，也有类似T_H亚群的表现^［11］。因此，检测PBMC中的IFN-γ染色阳性和IL-4染色阳性细胞，可更为全面地反映T_H亚群的分布情况，并且方法简便、快速，与ELISA方法测定细胞因子浓度比较具有一致性，为哮喘患者的免疫状态的评估、预后的判断提供了重要的免疫学指标，具有重要的临床实际应用价值。

　　志谢　邱林、吕洪德、奎如琴、赵秀梅、梁红、马萍、历建春对此研究工作的帮助和支持

　　基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(98-1-079)

　　作者单位：王　群(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　 　林江涛(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　 　孙洪涛(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　 　叶丽亚(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　 　李　静(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　 赵　武(100029北京，中日友好医院呼吸内科)

　　参考文献

　　1 Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al. two types of murine helper T cell clone. 1. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol, 1986, 136: 2348-2357.

　　2 Maggi E, Biswas P, Del-Prete G, et al. Accumulation of Th₂-like helper T cells in the conjunctive of patients with conjunctivitis. J Immunol,1991, 146: 1169-1174.

　　3 Ying S, Durham SR, Corrigan CJ,et al. Phenotype of cells expressing mRNA for Th2-type and Th1-type cytokines in bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies from atopic asthmatic and normal control subjects. Am J Respir Cell Mol biol, 1995, 12: 477-487.

　　4 Gavett S, Hearn DJ, Li X,et al. Interleukin 12 inhibits antigen-induced airway hyperresponsiveness, inflammation and Th2 cytokine expression in mice. J exp Med, 1995, 182: 1527-1536.

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　　6 Kopt M, Le-Gios G,Bachmann M,et al. Disruption of murine IL-4 gene blocks th2 cytokine responses. Nature, 1993, 362: 245-247.

　　7 Umetsu DT, Dekruyff RH. Th1 and Th2 CD⁺₄ cell in human allergic diseases. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100: 1-6.

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　　9 Busse WW, Gern JE. Viruses in asthma. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:147-150.

　　10 王前奔,叶丽亚,赵武述, 等. 人静脉血CD⁺₄ t细胞和单个核细胞中Th1和Th2细胞免疫组化检测的初步研究.中国免疫学杂志,1997, 13: 5-8.

　　11 山村昌弘. CD⁺₈ Th₂とサブレサ－ t细胞との关联. 临床免疫，1996, 28: 245-249.