哮喘豚鼠血红素氧合酶-1与内源性一氧化碳的相关性

中华儿科杂志 1999年第9期第0卷 论　著

作者：王虹　李华强　潘捷

单位：王虹　110042　沈阳，空军第四六三医院儿科；李华强、潘捷　第三军医大学野战外科研究所大坪医院儿科

关键词：血红素氧合酶；一氧化碳；GMP；哮喘

　　【摘要】　目的　探讨血红素氧合酶-1（HO-1）和内源性一氧化碳（CO）在哮喘发病机制中的作用及相互关系。方法　利用哮喘豚鼠模型及药物预防，用分光光度法检测豚鼠血一氧化碳血红蛋白（COHb）和血清及肺组织匀浆上清液HO-1活性水平，放射免疫竞争抑制法检测血浆cGMP。结果　哮喘组全血COHb (9.2±1.4)%；HO-1活性：血清（113.3±17.7） nmol/(L·h)、肺组织(55.5±5.6) nmol/(mg·h)；血清cGMP(1.59±0.30) pmol/mg，分别与地塞米松预防组和正常组比较差异有非常显著意义（t=11.51～22.47,P＜0.01）。地塞米松预防组与正常组比较，差异亦有非常显著意义（除cGMP外，P＜0.01）。血清与肺组织的HO-1活性水平呈正相关，且分别与血COHb和cGMP含量亦呈正相关（r=0.86～0.97, P＜0.01）。结论　哮喘时豚鼠体内HO-1活性、内源性CO和cGMP水平同时升高，三者在哮喘发病机制中具有重要的作用和必然的联系。

Relationship between heme oxygenase-1 and endogenous CO in asthma model of guinea pigs

WANG Hong^*， LI Huaqiang，PAN Jie.

　　^*Department of Pediatrics, Air Force 463 Hospital, Shenyang 110042

　　【Abstract】　Objective　To explore the mechanisms of heme oxygenase-1 (HO-1) and endogenous CO and the relationship between them in asthma.Methods　Guinea pig models of asthma were applied, some of them were treated with dexamethasone. Levels of HO-1 activity, COHb and cGMP in serum or lung tissue were determined by using spectrophotometry etc.Results　In acute asthmatic group, COHb in blood was (9.2±1.4)%, cGMP (1.59±0.30) pmol/mg and HO-1 activity was (113.2±17.7) nmol/(L·h) in serum and (55.5±5.6) nmol/(mg·h) in lung. These parameters significantly increased as compared with normal control group and dexamethasone-treated group (t=11.51～22.47, P＜0.01). However, all the above parameters except for cGMP of dexamethasone-treated group were higher than those of normal controls (P＜0.01). HO-1 activities in serum and lung tissue were positively correlated with each other or with the COHb and cGMP (r=0.86～0.97,P＜0.01).Conclusion　In asthma, the increased HO-1 activity resulted in increase of endogenous CO that can enhance cGMP.

　　【Key words】　Heme oxygenase　　Carbon monoxide　　Cyclic GMP　　Asthma

　　有研究发现哮喘患者肺呼出高浓度的内源性一氧化碳（CO）,并推测与血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）相关^［1,2］。为探索这种假设，我们实验利用哮喘豚鼠模型,研究两者在哮喘发病机制中的作用与相互关系。

　　材料和方法

　　一、哮喘动物模型制备和药理学干预

　　选择2月龄、饲养条件一致的健康雄性豚鼠30只(第三军医大学实验动物中心提供)，体重（150±20）g，完全随机分为3组:哮喘组、地塞米松预防组和正常组，每组10只。参照Huston等^［3］的方法，在实验第1、4、7天将1%卵蛋白（OVA）用402型超声雾化器面罩对哮喘组豚鼠雾化吸入3分钟致敏，第21天用2% OVA雾化吸入5分钟诱发其哮喘发作。地塞米松预防组在致敏的第16天给予地塞米松0.5 mg/（kg·d）腹腔注射，连续6天，诱发前12小时停药。正常组用生理盐水代替OVA致敏豚鼠，诱发同哮喘组。

　　二、标本制备

　　所有实验动物在诱发后24小时采集标本。实验豚鼠麻醉后，开胸暴露心脏，经右心室采集血液标本，部分全血立即做一氧化碳血红蛋白(COHb)测定，部分分离血清或血浆-70℃保存待测。将血排尽后，取肺组织(正常组同时取肝组织)，用冷0.1 mol/L KH₂PO₄缓冲液(pH 7.4)充分漂洗后，加4倍溶积同种缓冲液，用组织匀浆器匀浆，高速、低温(4℃)离心(13 000×g/分)15分钟后去除脂层，收集上清液-70℃保存待测。

　　三、检测项目和方法

　　1.全血COHb含量：采用双波长定量测定，参照乐宏元等的^［4］方法,新鲜血加入Na₂S₂O₄(保险粉)，使样品中多组份的血红蛋白转化为Hb和COHb两个组份，在721A型分光光度计上，用420 nm和432 nm两个波长测定吸光度，依比尔定律建立综合方程式，求出全血COHb的百分比含量（%）。

　　2．HO-1 活性测定:采用HO-1降解血红素生成胆红素和CO原理，测定样品反应物中胆红素生成量代表HO-1活性。分别取肺匀浆上清液和血清20 μl、加入2 mmol/L正铁血红素（美国Sigma公司提供）40 μl，4.5 mmol/L还原型辅酶Ⅱ（NADPH，德国Boehyinger Manneim公司提供）40 μl，同一只正常组豚鼠的肝组织匀浆上清液20 μl（作为胆绿素还原酶的来源,同时去除肝HO-1的干扰）、0.1 mol/L KH₂PO₄缓冲液（pH 7.4）1.8 ml，置37℃暗处10分钟，之后将反应物棕色小瓶置于冰上以终止反应。不含NADPH的样品作空白对照，样品与空白均做双份，在分光光度计上用464 nm和530 nm双波长测定胆红素生成量（胆红素摩尔吸光系数0.025 nm/cm）^［5］，其单位表示法：每小时每升血清或每毫克蛋白生成胆红素量（胆红素nmol/（L·h），nmol/(mg·h)。肺匀浆上清液蛋白含量的测定采用Lowry法。

　　3．肺匀浆上清液cGMP水平测定：采用碘¹²⁵标记的环磷酸鸟苷（I¹²⁵-cGMP）放射免疫竞争抑制分析法，按试剂盒说明操作（上海中医药学院提供），以每毫克蛋白生成量表示（pmol/mg）。

　　4．肺组织病理学检查：4%多聚甲醛固定、石蜡包埋的肺组织块切片，厚度5 μm，常规HE染色，光镜检查。

　　四、统计学处理

　　检验结果以均值±标准差()表示，采用显著性t或t′检验及直线相关分析法。

　　结果

　　一、 哮喘豚鼠模型一般情况及肺组织病理结果

　　哮喘组所有豚鼠均在致敏后21天经2% OVA诱导出哮喘发作症状，如烦躁、咳嗽、打喷嚏、呼吸加深加快，严重者口唇发绀等。其肺组织较正常组有明显的嗜酸粒细胞浸润和气道上皮肿胀、脱落。地塞米松预防组哮喘发作症状及肺组织病理改变明显较轻（仅肺泡腔内偶见嗜酸粒细胞）。正常组未出现哮喘发作症状，肺组织无异常改变。

　　二、血清和肺匀浆HO-1活性的变化（表1）

表1　各组血和肺组织各项指标检测结果比较()

　　注：t检验：^* P＜0.01;t′检验：^△ P＜0.01

　　哮喘组血清和肺匀浆HO-1活性同时增加，超过正常组血清3.27倍、肺组织4.56倍（P＜0.01）。地塞米松预防组较哮喘组明显下降（P＜0.01）,但仍高于正常水平。

　　三、全血COHb和肺组织cGMP水平的变化(表1)

　　哮喘组各项指标均明显高于地塞米松预防组和正常组(P＜0.01），差异有非常显著意义。地塞米松预防组血COHb也高于正常组(P＜0.01)，差异有非常显著意义，但肺组织cGMP水平与正常组之间差异无显著意义。

　　肺匀浆HO-1活性与血清HO-1活性、全血COHb和血浆cGMP均呈正相关（r分别为0.97、0.90、0.86，P均＜0.01），血清HO-1活性与COHb亦呈正相关（r=0.89, P＜0.01）。

　　讨论

　　参照Huston等方法制作的哮喘豚鼠模型与哮喘自然形成的变态反应相似。本组采用OVA雾化致敏豚鼠后，在诱发1～3分钟内均出现了哮喘发作症状如烦躁、打喷嚏、咳嗽、呼吸加深加快，口唇发绀等。肺组织细胞数和嗜酸粒细胞浸润明显增多，气道粘膜水肿、上皮不完整等病理改变，说明模型制作成功^［3］。

　　实验结果证明，哮喘豚鼠伴随哮喘症状加重，其血清和肺组织 HO-1活性水平明显升高，反之，地塞米松使哮喘症状减轻或缓解时，却使HO-1活性水平下降，这就提示HO-1参与了哮喘的发病机制。其增加机制可能解释如下：血红素氧合酶（HO）系统是由HO-1、HO-2和HO-3^［6］构成，HO-2与HO-3不被诱导，HO-1可被诱导^［3］，易受哮喘时的许多种因素影响而可能诱导肺巨噬细胞、浸润的嗜酸性粒细胞、气道平滑肌和上皮细胞、血管平滑肌和内皮细胞等HO-1 mRNA的转录，导致HO-1蛋白合成和活性明显增加^［2］，所以，哮喘时血清HO-1活性水平升高，检测血清HO-1活性能反映肺HO-1活性和蛋白合成的状态。

　　因本实验动物无吸烟史及CO吸入或中毒史，所以全血COHb含量测定可以代表内源性CO水平。实验结果表明哮喘豚鼠体内内源性CO和cGMP水平在哮喘时伴随HO-1活性水平升高而上升，而在哮喘症状减轻或缓解时，随HO-1水平下降而同时降低，这与Zayasu等^［1］的推测相一致，这说明HO-1 与CO在哮喘发病机制中存在着必然的联系。 Maines等^［2］认为HO系统是产生内源性CO的唯一途径，血红素经HO系统降解生成胆红素和CO，而经其它方式降解的血红素不生成CO。因此，哮喘时体内内源性CO水平升高与HO-1活性增加密切相关。

　　已证明CO与NO一样具有第二信使分子样作用，它作为可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）分子血红素部分的配体，与其结合而激活sGC^［2］，间接介导cGMP生成增加。哮喘时细胞内增多的CO可能弥散到临近的细胞内，激活局部和临近的细胞内的sGC，能使cGMP大量地生成，介导哮喘的病理生理功能改变。

　　另一方面，HO-1、CO和cGMP又能促进肺巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞等合成和释放炎症介子，如组织胺、白细胞三烯、血小板活化因子、前列腺素等，分泌炎性细胞因子如IL-1、IL-4、IL-5和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，从而参与哮喘气道的变应性炎症和上皮等肺组织的损伤过程，进而又导致气道平滑肌收缩、增生肥大，使气道阻力增加而增强哮喘的气道高反应性。因此，HO-1、CO和cGMP在哮喘中的双重作用需进一步探讨。

　　参考文献

　　1　Zayasu K,Sekizawa K,Okinaga S,et al. Increased carbon monoxide in exhaled air of asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med, 1997,156:1140-1143.

　　2　Maines MD. The heme oxygenase system : a regulation of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1997,37:517-554.

　　3　Huston PA, Church MK, Clay TP, et al. Early and late phase bronchocontriction after allergen challenge of nonanesthetized guinea pigs. Am Rev Respir Dis,1988,137:548-557.

　　4　乐宏元，宋小兴，刘和平.一氧化碳血红蛋白双波长定量测定.临床检验杂志，1996，14：87-88.

　　5　Yet SF,Pellacani A,Patterson C,et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in vascular smooth muscle cell. J Biol Chem, 1997,272:4295-4301.

　　6　McCoubrey WK, Huang JTJ, Maines MD. Isolation and characterization of a cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygense-3.Eur J Biochem, 1997,247: 725-732.

（收稿：1998-05-13　　修回：1999-06-02）