哮喘患者外周血单个核细胞中Th1/Th2类细胞因子的偏移状态及红霉素的纠偏作用

中华结核和呼吸感染 2000年第6期第23卷 论　　著

作者：肖伟　郑春燕　董亮　余惠　田志刚

单位：肖伟　郑春燕　董亮(山东医科大学附属医院呼吸科　济南,250012)；余惠(上海第一肺科医院肺科)；田志刚(山东省医学科学院基础所肿瘤生物治疗中心)关键词： 哮喘；细胞因子；基因检测；红霉素

　　【摘要】目的　观察支气管哮喘患者外周血单个核细胞（PBMC）中T辅助淋巴细胞两个功能性亚群（Th1/Th2）的功能状态及红霉素对其的影响。方法　23例哮喘患者及正常对照组10名，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，以白细胞介素2（IL-2）和干扰素γ（IFN-γ）代表Th1类细胞因子，IL-4、6、10代表Th2类细胞因子，分别检测了两组PBMC加红霉素体外培养前、后上述各种因子mRNA的表达。 结果　哮喘患者Th2类因子IL-4、6、10阳性表达例数分别为18/23、19/23和10/23，Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2阳性表达例数分别为1/23和13/23，而正常对照组Th2类因子IL-4、6、10阳性表达例数分别为0/10、2/10和1/10，Th1类因子IL-2和IFN-γ的阳性表达例数均为1/10。与正常对照组比较，哮喘患者PBMC中的Th2类细胞因子IL-4、IL-6阳性表达率显著增高（P分别=0.00003、0.001）。加红霉素培养后哮喘患者PBMC中Th1/Th2类细胞因子出现明显变化，表现为对IL-4、IL-6的显著下调作用（18/23：5/23，P=0.0006、19/23：9/23，P=0.006），Th1类因子IFN-γ表达阳性率有所增高，IL-2表达有所下降（但未达到统计学意义），从而接近正常对照组水平。正常对照组加红霉素培养前、后比较差异无显著性（P＞0.05）。若以IFN-γ/IL-4来衡量哮喘患者PBMC中Th1/Th2之间的平衡，显然哮喘患者PBMC中Th1/Th2类因子表达呈现Th2的偏移状态。经红霉素作用后，可见哮喘患者的Th1/Th2失衡状态得到纠正。 结论　哮喘患者PBMC中Th1/Th2类细胞因子mRNA表达处于Th2方向的偏移状态；红霉素可显著下调哮喘患者PBMC中的IL-4和IL-6 mRNA的表达而使其偏移状态得到逆转。

The imbalance of Th1/Th2 cytokine expression in peripheral blood mononudear cell from asthmatic patients and the effect of erythromycin on these cytokines

XIAO Wei，YU Hui，ZHENG Chunyan，et al.(Respiratory Department of the Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan 250012,China)【Abstract】Objective　To observe the state of Th1/Th2 cytokine expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from asthmatic patients and the effect of erythromycin (Ery) on it.Methods　23 asthmatic patients and 10 healthy volunteers were included.The mRNA expression for Th1/Th2 cytokines in PBMC before and after the culture with Ery were detected by RT-PCR，considering IL-2 and IFN-γ as Th1 cytokines,and IL-4,IL-6,IL-10 as Th2 ones.Results　The positive rate of mRNA expression for Th2-derived IL-4,IL-6,IL-10 in the study group were 18/23,19/23 and 10/23 respectively,and those for IFN-γ and IL-2 produced by Th1 cells were 1/23 and 13/23 ,respectively.In the control group,the positive rate for IL-4,IL-6,IL-10 were 0/10,2/10 and 1/10,respectively,and those for IL-2 and IFN-γ were both 1/10.Comparing with the control group,the positive rate of mRNA expression for IL-4 and IL-6 in PBMC from asthmatic patients were significantly higher (P=0.000 03,0.001 respectively).After the culture with Ery for 48 h,the positive rate for IL-4 expression in the study group decreased from 18/23 to 5/23 （P=0.0006），and IL-6 from 19/23 to 9/23 (P=0.006).The positive rate for IFN-γ experssion was elevated while IL-2 decreased(But both had no statistical significance).There was no difference observed before and after the culture with Ery in the control group.Conclusions　There is a predominant expression of Th2-type cytokines in PBMC from asthmatic patients.Ery can down-regulate the mRNA expression for IL-4 and IL-6 in asthmatic patients,and might convert the imbalance of Th1/Th2 cytokine expression in asthmatic patients.【Key word】Asthma；Cytokine；Gene detection；Erythromycin支气管哮喘是由多种炎性细胞参与的气道慢性炎症。众多的研究表明，T细胞及其分泌的各种因子在气道的慢性炎症中发挥重要作用。目前T辅助淋巴细胞两个功能性亚群（Th1/Th2）在支气管哮喘发病中的作用已引起人们关注。Th1/Th2在支气管哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的状态及其影响因素鲜有报道。我们以白细胞介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN-γ）代表Th1类细胞因子，IL-4、IL-6、IL-10代表Th2类细胞因子，分别检测了支气管哮喘患者和正常人外周血单个核细胞（PBMC）中Th1/Th2类细胞因子mRNA的表达，并观察了红霉素对支气管哮喘患者和正常人PBMC中Th1/Th2类细胞因子mRNA表达的影响。

　　对象与方法一、对象将支气管哮喘患者和健康志愿者分为：病例组23例：男7例，女16例，年龄19～47岁，平均年龄（33±9）岁，为非急性发作期哮喘患者，病情以中度为主，诊断符合1997年全国哮喘病学术会议通过的诊断及病情评价标准^［1］；无吸烟史，近2周未用过糖皮质激素，茶碱类药和β受体激动剂。对照组10名：男4名，女6名，年龄23～42岁，平均年龄（30±6）岁，均为健康志愿者。无哮喘及其他呼吸系统疾病，无过敏性疾病，近1周来未服用过任何药物。二、方法1.标本采集：晨8～10 h空腹取肘静脉血10 ml，肝素抗凝（25～50 U/ml）。2.PBMC的分离与培养：淋巴细胞分层液分离PBMC，悬浮于RPMI 1640溶液中，分为三组，一组立即离心冻存（A组）:一组加入红霉素体外培养（B组），一组加入等体积1640液体外培养作为对照（C组）。培养体系中加入植物血凝素（PHA）。各组份的终浓度为：PBMC 1×10⁶/ml、 红霉素15 μg/ml、PHA 0.15 mg/ml，置于37℃、5% CO₂孵箱中孵育48 h后，收集细胞，生理盐水洗涤2遍，离心获得细胞沉淀，-70℃冻存待测。3.细胞因子mRNA表达的检测：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，操作依照试剂盒说明书。按异硫氰酸胍酚/氯仿一步法提取细胞总RNA，莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）作用下经逆转录得到 DNA模板进行PCR扩增。PCR产物经1，5%琼脂糖凝胶电泳观察结果，以PCR-marker标记DNA条带位置。5种细胞因子的引物序列见表1。统计学处理：哮喘组与正常对照组之间及其A、B、C三组间PBMC中细胞因子 mRNA表达阳性率差异采用χ²检验（确切概率法）。

表1　RT-PCR检测Th1/Th2相关五种细胞因子的引物序列

　　结果　　哮喘患者与正常对照组比较，其PBMC中Th2类细胞因子IL-4、IL-6呈明显的强势表达。哮喘患者PBMC加红霉素体外培养后，Th1/Th2类细胞因子mRNA表达出现较明显变化，表现为IFN-γ阳性表达增加，IL-2、IL-4和IL-6表达降低，其中IL-4和IL-6的变化具有显著意义；哮喘患者空白培养组PBMC中Th1/Th2类因子的表达与培养前比较差异无显著性。经红霉素作用后，哮喘患者PBMC中Th1/Th2类细胞因子mRNA表达接近正常对照组水平； 而正常对照组的PBMC中Th1/Th2类细胞因子表达经红霉素作用后无明显变化，见表2，图1，2。

A：PCR-Marker：1 000、750、500、300、150、50 bp B：IL-2(+) C：IFN-γ(-) D：IL-4(+) E：IL-6(+) F：IL-10(+)

图1　哮喘患者PBMC中细胞因子RT-PCR检测结果

表2　哮喘组与正常对照组及其用红霉素前、后（A、B组）PBMC中Th1/Th2类细胞因子mRNA表达阳性率比较(例数)

　　注：P值为哮喘组或对照组红霉素培养前、后比较；^*P值为哮喘组与对照组之间的比较

A：PCR-Marker：1 000、750、500、300、150、50 bp B：IL-2(-) C：IFN-γ(-) D：IL-4(-) E：IL-6(-) F：IL-10(-)

图2　正常人PBMC细胞因子检测结果

　　讨论支气管哮喘是一种慢性气道炎性疾病，与机体免疫紊乱有关。IgE和其它类型的Ig升高是其触发因素之一。多年来许多学者极力解开哮喘患者IgE和其它Ig升高的的免疫学机制，尚无较为公认的结论。近年来Th1/Th2的研究表明，机体的某些疾病如感染，过敏和自体免疫紊乱的广泛病理过程的结果与Th1和Th2类细胞因子的表达模式有关^［2］。Th1类细胞因子［IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF-α）、TNF-β等］主宰机体的细胞免疫，该类细胞因子的不足将易感肿瘤，病毒性疾病和胞内寄生虫病。Th2类细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等）主宰体液免疫，该类因子的过度表达则与体液免疫异常有关，如某些自体免疫性疾病、过敏性疾病等。两类细胞因子正常应处于一种平衡状态，过高者则称为强势状态。本组资料显示，哮喘患者PBMC中Th2类因子IL-4、IL-6有较高的表达率，与正常对照组比较差异有非常显著性，而Th1类因子IFN-γ仅1例表达，正常对照组的PBMC中IL-4无一例表达。IL-4和IFN-γ在支气管哮喘发病中的正负作用已引起许多研究者的关注。IL-4在哮喘炎症过程中被认为是起主导作用的因子：它诱导IgE产生^［3］，提高内皮细胞表面的血管细胞粘附分子1（VCAM-1）的表达，诱导嗜酸细胞和嗜碱细胞对内皮细胞的粘附作用，使之向气管内聚集^［4］，导致气道的慢性持续性炎症。IFN-γ目前被认为是一种抗支气管哮喘因子。它可抑制变态反应，是IL-4合成的生物拮抗剂，降低B淋巴细胞过度合成IgE，并抑制Th2型细胞增生^［3，5］。Horwitz等^［5］曾用中医的“阴阳平衡”来比喻过敏性疾病中IFN-γ和IL-4之间的关系，认为过多的IL-4或IFN-γ的缺乏可以引发lgE反应，相反，增加IFN-γ的浓度或降低IL-4的水平则可抑制上述过程。从本组研究结果来看，若以IFN-γ/IL-4来衡量支气管哮喘患者PBMC中Th1/Th2之间的平衡，显然其细胞因子的表达呈Th2方向的偏移状态，而正常人则呈无表达或Th1/Th2均有表达（本组资料仅1例）的状态。这种支气管哮喘患者PBMC中Th2类因子的强势表达或Th1/Th2之间的不平衡状态，在哮喘的炎症过程中可能具有重要意义。由表2可见，哮喘患者IL-2的表达率亦明显高于正常对照组。Th1与Th2细胞发育自共同的前体细胞Th0，其在抗原初始刺激下主要分泌IL-2。本组结果提示，哮喘患者存在明显的Th0的活化状态。红霉素属大环内酯类抗生素，近年来被认为具有免疫调节作用，但其作用机制尚无深入研究报道。Takizawa等^［6］的研究表明，红霉素可抑制支气管上皮细胞IL-6的表达。我们的资料显示，红霉素可明显下调支气管哮喘患者PBMC中增高的IL-4和IL-6的m-RNA表达，对IL-2的表达有一定的抑制，IFN-γ表达阳性率则有所增高（虽无统计学意义）。支气管哮喘患者PBMC经红霉素作用后，其Th1/Th2类因子表达的偏移状态被逆转，从而与正常对照组的差别消失。正常人的PBMC对红霉素反应则不敏感。由此可见，红霉素可使支气管哮喘患者PBMC中Th0过度活化和Th2类因子的偏移状态得以纠正，从而趋向正常人的状态。这对于解释红霉素治疗支气管哮喘或其他特应性炎性疾病的机制可能具有重要意义。

　　参考文献1，中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南（支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案）.中华结核和呼吸杂志,1997，20:261-267.2，Schleimer RP,Sterbinsky CA,Kaiser CA,et al.Interleukin-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium:association with expression of VCAM-1.J Immunol,1992,148:1086-1092.3，Romagniani S.Regulation and deregulation of human IgE synthesis.Immunol Today,1990,11:316-321.4，Abbas AK，Murphy KM，Sher A.Functional diversity of helper T lymphocytes.Nature,1996,383:787-793.5，Horwitz RJ，Busse WW.Inflammation and Asthma.Asthma,1995,16:583-602.6，Takizawa H，Desaki M，Ohtoshi T，et al.Erythromycin supperlesses interleukin-6 expression by human bronchial epithelial cells：a　potential mechanism of its anti-inflammatory action.Biochemical and Biophysical Research Communications,1995,210:781-786.

(收稿日期：1999-09-02)