地塞米松对哮喘豚鼠气道炎症细胞凋亡的影响

中华结核和呼吸感染 1998年第11期第0卷 论著

作者：欧阳能太　丁静　陈思蓓　钟南山

单位：510120 广州，广州呼吸疾病研究所

　　关键词： 哮喘；豚鼠；凋亡；激素

　　【摘要】　目的　炎症细胞的清除是哮喘治疗效果的关键。探讨地塞米松治疗是否以凋亡形式清除哮喘粘膜组织中的炎症细胞。方法　采用卵蛋白诱导的豚鼠哮喘模型以地塞米松作治疗,用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的脱氧三磷酸尿嘧啶（dUTP）末端标记(TUNEL)法进行凋亡细胞的标记。以免疫组化标记活化的嗜酸性粒细胞蛋白（EG₂）以及T淋巴细胞的CD⁺₃，CD⁺₄和

　　CD⁺₈。对皮质激素组和对照组气道粘膜组织中的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞及其它们的凋亡指数进行了比较研究。结果（1）皮质激素处理前、后嗜酸性粒细胞数量和淋巴细胞数量比较，差异有显著性（P＜0.01）。（2）淋巴细胞凋亡指数(%)对照组为4.56±0.87,皮质激素组为5.92±0.83，两组比较差异有显著性(P＜0.05)；嗜酸性粒细胞的凋亡指数两组间差异无显著性。（3）皮质激素处理后，EG₂阳性的嗜酸性粒细胞所占比例明显减少（P＜0.01）；皮质激素处理组的CD⁺₄与对照组比较，差异有显著性（P＜0.01）；而CD⁺₈则相反，皮质激素组与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。结论　(1)皮质激素预处理可减少哮喘豚鼠气道粘膜中嗜酸性粒细胞的数量，其机制可能主要非因促进嗜酸性粒细胞凋亡所致。（2）皮质激素可减少气道组织中淋巴细胞的数量，主要为CD⁺₄的减少，其中一个途径是通过促进淋巴细胞凋亡而实现的。

　　Effects of dexamethasone on apoptosis of airway inflammatory cells in asthmatic guinea-pigs　　Ouyang Nengtai, Ding Jing, Chen Sibei, et al. Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou 510120

　　【Abstract】　Objective　Clearance of airway inflammatory cells is the key point of therapeutic effect in asthma. Apoptosis, a form of cell death, is thought to be critically important to promote the clearance of inflammatory cells and the resolution of inflammation. To investigate the effects of dexamethasone on apoptosis of airway inflammatory cells in asthma showed be very important.Method　Dexamethasone was used for the treatment of asthma model of guinea pigs set up by inhaling ovalbumin. Apoptotic cells were labelled with TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) technique on formalin-fixed paraffin-embedded trachea and lung tissue sections. By way of immunohistochemistry, eosinophils were stained with EG₂ antibody and T lymphocytes with CD⁺₃,CD⁺₄ and CD⁺₈ antibodies on sections.Result　(1) The quantity of airway eosinophils and lymphocytes decreased in dexamethasone group, which could not be observed in the control one (P＜0.01). (2) Apoptotic index of lymphocytes was significantly elevated following dexamethasone treatment(P＜0.05). But no difference was found in the proportion of apoptotic eosinophils between these two groups. (3) The percentage of EG₂ positive eosinophils and CD^＋₄ positive lymphocytes decreased significantly following dexamethasone treatment. On the contrary, the number of CD⁺₈ lymphocytes increased in dexamethasone group when compared with the control one (P＜0.05).Conclusion　(1) The quantity of airway eosinophils decreases following dexamethasone treatment in guinea-pigs asthma, and its mechanism may not be ascribed mainly to the apoptosis of eosinophils. (2)The number of lymphocytes, mainly CD⁺₄, decreased following dexamethasone treatment in guinea-pig airways, and apoptosis may represent the mechanism that promotes the clearance of lymphocytes in asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Guinea-pig　　Apoptosis　　Dexamethasone

　　气道粘膜嗜酸性粒细胞等炎症细胞的大量聚集及脱颗粒是哮喘的主要病理改变之一。炎症细胞的清除是治疗效果的关键，其方式有两种，即坏死和凋亡，前者细胞内容物溢出,加重组织的炎症反应。后者则形成凋亡小体,被周围细胞吞噬,不引起炎症反应。皮质激素是目前治疗哮喘的主要药物之一，其清除炎症细胞的方式是坏死还是凋亡尚不清楚，弄清这一问题将对从炎症细胞凋亡角度提高对哮喘的疗效具有重要意义^［1］。我们以哮喘动物模型,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧三磷酸尿嘧啶(dUTP)末端标记法(即TUNEL法)对粘膜组织中炎症细胞的凋亡进行原位标记,对皮质激素处理前、后气道嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的凋亡进行了比较研究。

材料与方法

　　1.动物模型：20只雌性纯白豚鼠，重200～250 g(购自第一军医大学实验动物中心，粤检证字第P6A27号)。采用我们以前用过的方法诱喘动物^［2］，以10%卵蛋白(美国Sigma公司产品)混悬液1 ml腹腔注射致敏。15天后以1%卵蛋白雾化吸入诱喘，每次吸入30秒，出现呼吸频率加深、加快及点头运动等为喘息症状，每天诱喘1次共3天。然后将动物分成皮质激素组和对照组各10只。皮质激素组肌注地塞米松0.5毫克/只，每天1次共5天，对照组肌注生理盐水，每天1次共5天。再诱喘并处死动物，取肺组织以10%中性甲醛固定24小时，石蜡包埋及切片，厚4 μm，分别做HE染色、免疫组化和TUNEL标记。

　　2.凋亡细胞的标记：原理：细胞发生凋亡时，DNA链断裂并暴露出3′羟基端，在TdT的作用下，各种脱氧三磷酸核苷（dNTP）可以连接到3′羟基端上，预先标记其中一种dNTP（如dUTP）,即可检测出DNA的断裂点，后者为细胞凋亡的特征。原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，主要过程按试剂说明书进行，部分步骤作了改良。(1)石蜡切片经脱蜡及梯度酒精脱水，PBS洗5分钟；(2)3%过氧化氢10分钟， PBS洗5分钟2次；(3)于0.01 nmol枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波(750W)处理2分钟，冷却20分钟，PBS洗5分钟2次；(4)入10%胎牛血清中作用30分钟，PBS洗5分钟2次；(5)加入TUNEL工作液（包含有TdT以及各种dNTP，其中dUTP由荧光素标记），室温下孵育90分钟，PBS洗5分钟3次；(6)加入辣根过氧化物酶标记的抗荧光抗体(Converter-POD)，室温下孵育40分钟，PBS洗5分钟3次;(7)3′，3′-二甲基联苯氨(DAB)显色,苏木素及伊红复染,流水冲洗15分钟,中性树胶封片。

　　3.免疫组化染色：CD⁺₃，CD⁺₄和CD⁺₈即用型抗体以及S-P试剂盒为福州迈新公司产品，EG₂单抗购自瑞典Pharmacia公司。组织切片经微波处理，按试剂说明常规方法进行染色。

　　4.细胞计数及统计处理: 以支气管壁的周长为单位(细胞个数/100微米)计数嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量，凋亡细胞所占相应细胞的百分比即为凋亡指数(AI)。每张切片计算4个支气管,求其均值。结果用方差分析作统计处理。免疫组化结果均计算阳性细胞所占相应细胞的百分数。

结果

　　皮质激素组豚鼠用药后雾化吸入1%卵蛋白30秒均不能诱喘,而对照组诱喘30秒则出现明显的喘息症状。组织切片的嗜酸性粒细胞主要分布于气管及各级支气管的粘膜层（图1），少部分见于支气管周围及肺泡组织。(1)嗜酸性粒细胞计数(细胞个数/100微米)：皮质激素组为38.7±1.5,对照组为55.0±3.0, 皮质激素处理组粘膜中嗜酸性粒细胞明显较对照组减少(P＜0.01)。(2)淋巴细胞计数(细胞个数/100微米)：皮质激素组为49±4,对照组为71±4, 两组比较差异有显著性(P＜0.01)。TUNEL染色凋亡细胞核呈棕褐色。(3)淋巴细胞凋亡指数：对照组为5.6±0.9,皮质激素组为5.9±0.8, 两组比较差异有显著性(P＜0.05，图2）。嗜酸性粒细胞的凋亡指数两组间差异无显著性。EG₂阳性细胞占嗜酸性粒细胞的比例为：皮质激素处理组为48%±6%,对照组为64%±9%，两组比较差异有显著性(P＜0.01)。(4)CD⁺₃、CD⁺₄和CD⁺₈标记的结果：经皮质激素处理后，CD⁺₄所占比例明显减少，而CD⁺₈则有所升高。CD⁺₃无明显变化(附表)。

附表　皮质激素处理前、后粘膜组织中淋巴细胞亚群的变化(±s)

图1　哮喘豚鼠气道粘膜大量嗜酸性粒细胞浸润，但未见凋亡的嗜酸性粒细胞　TUNEL法　×400

图2　皮质激素处理后，豚鼠气道粘膜炎症细胞减少，淋巴细胞凋亡(箭头所示)的比例增加　TUNEL法　×400

讨论

　　细胞死亡被认为是哮喘气道粘膜组织中大量聚集的嗜酸性粒细胞等炎症细胞被清除的主要途径^［3］。其方式有两种即坏死和凋亡。前者细胞内容物溢出,造成死亡细胞周围的炎症反应。后者则形成凋亡小体,被周围细胞吞噬,不造成炎症反应。体外实验已经证明多种细胞因子可以明显地抑制嗜酸性粒细胞的凋亡^［4］。相反,嗜酸性粒细胞的培养在去掉粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的情况下,则可导致凋亡的发生^［5］。另外,细胞外间质纤连蛋白^［6］和磷酸化酪氨酸等均被认为参与了嗜酸性粒细胞凋亡的调控。但在体内的研究仅见Woolley等^［3］文献报道，其研究发现，皮质激素治疗后哮喘患者痰中嗜酸性粒细胞凋亡的比例明显较对照组高。提示皮质激素有可能诱导嗜酸性粒细胞的凋亡。但皮质激素对气道组织中浸润的炎症细胞凋亡的作用尚未见文献报道。而后者才是在哮喘中起主要作用的细胞。

　　我们的结果显示，皮质激素治疗组粘膜组织中的淋巴细胞凋亡指数较对照组高,说明皮质激素可诱导组织中淋巴细胞的凋亡，且可能主要是CD⁺₄即辅助型T淋巴细胞的凋亡。提示气道组织中淋巴细胞的数量减少，可能是通过促进淋巴细胞凋亡而实现的。本组动物模型经皮质激素处理后，气道组织中嗜酸性粒细胞明显减少，但皮质激素组和对照组组织中嗜酸性粒细胞的凋亡均较少见到。说明嗜酸性粒细胞的减少主要非因凋亡所致。推测组织中可能存在抑制嗜酸性粒细胞凋亡的因素（如GM-CSF），而且这些因素不能被皮质激素所拮抗。在其它细胞的研究^［7］中已经证明，皮质激素既可诱导凋亡亦可抑制凋亡的发生。其作用途径可能是间接的。推测皮质激素诱导嗜酸性粒细胞凋亡的过程还可能受其它因素的调控。

参考文献

　　1　Stern ML, Meagher L, Savill J， et al. Apoptosis in human eosinophils: programmed cell death in the eosinophil leads to phagocytosis by macrophages and is modulated by IL-5. J Immunol，1992,148:3543-3549.

　　2　欧阳能太, 刘朝晖,钟南山. 内皮素1在哮喘豚鼠气道中的分布. 中华结核和呼吸杂志，1995,18:151.

　　3　Woolley KL, Gibson PG, Carty K,et al.Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med，1996,154:237-243.

　　4　Suzuki S, Okubo M, Kaise S, et al. Gold sodium thiomalate selectivity inhibits interleukin-5 mediated eosinophil survival. J Allergy Clinical Immunology，1995,96:251-256.

　　5　Simon HU， Blaser K.Inhibition of programmed eosinophil death: a key pathogenic event for eosinophilia? Immunology Today, 1995,16:53-55.

　　6　Higashimoto I, Chibala J, Kakazu T,et al. Regulation of eosinophil cell death by adhesion to fibronectin. International Archives of Allergy Immunology，1996,111 (Suppl 1):66-69.

　　7　Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer，1994,73:2013-2026.

(收稿：1998-04-30　　修回：1998-07-17)