哮喘患者辅助T细胞活化与白细胞介素5释放
中华结核和呼吸感染 1998年第10期第21卷 论著
作者：全宝文 唐迟兵 王东亮 熊一霞 闫鸿 高军
单位：110003 沈阳，解放军第二○二医院呼吸内科
关键词： 哮喘；过敏症；白细胞介素类；过敏原刺激；T细胞活化
【摘要】 目的 了解过敏状态和哮喘状态下辅助(CD+4)T细胞活化及白细胞介素5(IL-5)释放的原因和作用。方法 对过敏性哮喘组12例(AA)、非过敏性哮喘组10例(NAA)、过敏性非哮喘组9例(AN)及正常对照组10名(N)在有无抗原刺激下进行支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞及周围血单个核细胞(PBMC)培养，比较组内和组间CD+4T细胞活化（标志物CD+25)与IL-5释放水平。结果 PBMC在无抗原刺激下培养，4组CD+4、CD+25％比较差异无显著性。PBMC和支气管肺泡灌洗(BAL)细胞在抗原刺激下培养，CD+4、CD+25％两过敏症组(AA、AN)比较(P＜0.01)。BAL细胞在无抗原刺激下培养,两哮喘组(AA、NAA)CD+4、CD+25％比较(P＜0.05和P＜0.01)；而BALF和PBMC自发释放IL-5能力，两哮喘组与非哮喘组及正常对照组比较(P＜0.05或P＜0.01）。在抗原刺激下PBMC和BALF细胞培养，IL-5在两哮喘组和过敏性非哮喘组均有明显差异。BALF细胞中IL-5又高于PBMC。结论 抗原刺激是过敏症患者CD+4T细胞活化和IL-5释放的重要原因。CD+4T细胞活化和IL-5释放增高是过敏性和非过敏性哮喘共同特征,这一特征与哮喘状态有关，又与过敏状态有关。
CD+4T cell activation and IL-5 production in atopic and nonatopic asthmatics Quan Baowen,Tang Chi-bing,Wang Dongliang et al,The 202nd Hospital,PLA,Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To understand the reasons and roles of CD＋4T cell activation and IL-5 production in atopic and asthmatic patients.Method Bronchoalveolar lavage(BAL) cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 12 atopic and 10 nonatopic asthmatics, 9 atopic nonasthmatics, and 10 normal controls were cultured with or without house dust mite(HDM),CD+4T cell activation, and IL-5 production were assessed.ResultThe percentage of CD＋4、CD+25 in unstimulated PBMC cultures were not significantly different in the four groups, but it increased following HDM stimulation in both PBMC and BAL cultures in two atopic groups(P＜0.01). The percentage of CD+4、CD+25 in unstimulated BAL cell culture increased in two asthmatic groups (P＜0.05, P＜0.01). The levels of spontaneous IL-5 released from both BALF cells and PBMC in two asthmatic groups were higher than those in AN and N (P＜0.05, P＜0.01).A siginficant elevation in IL-5 release following HDM stimulation in PBMC and BALF cells was observed in the both asthmatic and atopic groups;but the value in AA was higher than that in NAA, and it was also higher in BALF cells than in PBMC.Conclusion The allergen stimulation is important reasons for CD+4T cell activation and IL-5 production in atopics. CD+4T cell activation and IL-5 production are common feature in atopic and nonatopic asthma, it correlates with both asthmatic and atopic status.
【Key words】 Asthma Anaphylaxis Interleukins Allergen challenge T cell activation
以往研究证明，活化的CD+4T细胞和嗜酸细胞(EOS) 浸润支气管粘膜是支气管哮喘的特征［1，2］。EOS可引起支气管上皮损伤和气道反应性增高。活化的T细胞通过所产生的一系列细胞因子启动和调控EOS气道炎症;主要由CD+4T细胞产生的白细胞介素5(IL-5)对EOS聚集和活化起特殊作用［3，4］;并认为IL-5的产生与过敏性疾病有关［5～7］。我们旨在有无抗原刺激条件下，进行支气管肺泡灌洗(BAL)和周围血单个核细胞(PBMC)培养,分别测定哮喘状态和过敏状态下的CD+4T细胞活化与IL-5释放水平及其相关因素。
对象与方法
1.受试对象分4组：(1)过敏性哮喘组(AA组)：12例，男6例，女6例,年龄20～48岁；(2)非过敏性哮喘组(NAA组)：10例，男5例，女5例，年龄19～54岁；(3)过敏性非哮喘组(AN组)：9例，男6例，女3例，年龄23～52岁；(4)正常对照组(N组)：10名，男8名,女2名,年龄19～47岁。 两哮喘组(AA和NAA组)患者均有周期喘息发作史并需间断使用β2激动剂，气道阻塞具有可逆性［吸入β2激动剂后一秒钟用力呼气容积(FEV1)改善超过20％］，3个月内未用过皮质类固醇。AN组包括过敏性鼻炎6例，结膜炎3例，均无哮喘症状，FEV1正常。两过敏症组(AA和AN组）均对屋尘螨(HDM)抗原皮试阳性。非过敏症组(NAA)和N组对常见空气过敏原皮试阴性，N组无哮喘史，FEV1正常。哮喘诊断均符合中华医学会1993年支气管哮喘评定标准。根据16种常见过敏原皮肤试验结果和临床特点，将哮喘患者分为过敏性哮喘组和非过敏性哮喘组，所有患者、正常对照组在实验前均征得同意，做BAL、组胺吸入试验和抽取静脉血，全部实验在国内完成。
2.实验方法：组胺吸入试验：该试验在纤维支气管镜(纤支镜)检查前按中华医学会呼吸学会拟定的气道反应性测定方法(试行方案)进行。气道反应性指标(使FEV1较基础值下降20％所需激发浓度对数，反对数为PC20-FEV1值作为气道反应性指标)，PC20＜8 g/L为气道反应性增高。
BAL：BAL按1994年中华医学会呼吸病学会支气管肺泡灌洗操作规范进行。纤支镜楔入右肺中叶内侧段支气管开口处，经活检孔分3次注入37℃生理盐水150 ml，聚乙烯管回收BAL液，立即冷藏。
PBMC及BAL细胞培养：纤支镜检查前取静脉血30 ml抗凝,Ficoll-Hypaque液分离出PBMC。BAL细胞和PBMC均以RPMI-1640悬浮，调整悬浮液细胞浓度至2×106/ml，转至24孔无菌组织培养板(每孔/毫升)，加入HDM(美国Greer laboratories公司提供),最终浓度10 mg/L。5％二氧化碳、37℃,BAL细胞培养3天,台盼蓝染色,细胞存活率＞60％；PBMC培养5天,细胞存活率＞80％。
CD+4、CD+25T细胞检测：离心BAL液细胞和PBMC培养悬浮液,沉淀细胞以磷酸盐悬浮,CD＋4、CD+25荧光单克隆抗体染色(4℃,孵育20分钟),流式细胞仪扫描，分析10 000个细胞，获得免疫荧光阳性细胞数。敏感度为25 μg/L，变异系数为10％。
IL-5释放水平检测：BAL细胞和PBMC培养上清液用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测。按美国PharMinge公司提供的操作程序进行。
数据分析:组胺PC20采用t检验;活化的CD+4T细胞百分数和细胞因子水平的组间比较采用Mann-Whitney U检验;组内比较采用Wilcoxon检验。所有数据分析均采用微型统计软件包分析，P＜0.05认为有统计学意义。
结果
一、肺功能检测
FEV1及气道反应性(组胺PC20值)测定结果见表1。
表1 四组患者FEV1%及组胺PC20值比较(x±s)
| 组别 |
例数 |
FEV1% |
PC20 |
| 过敏性哮喘组 |
12 |
82±16 |
0.73±0.53△ |
| 非过敏性哮喘组 |
10 |
84±10 |
0.76±0.48△ |
| 过敏性非哮喘组 |
9 |
92±13 |
11.2±7.4 |
| 正常对照组 |
10 |
104±15 |
|
注：与对照组比较P＜0.05，与过敏性非哮喘组比较△P＜0.05
二、BAL细胞分类
BAL细胞分类，见表2。
表2 四组患者BAL液中细胞分类(x±s)
| 组别 |
例数 |
中性粒细胞(%) |
嗜酸细胞(%) |
| 过敏性哮喘组 |
12 |
2.9±1.7 |
2.4±2.0△ |
| 非过敏性哮喘组 |
10 |
2.8±1.4 |
2.5±2.1△ |
| 过敏性非哮喘组 |
9 |
1.9±0.9 |
0.4±0.8 |
| 正常对照组 |
10 |
1.6±1.1 |
0.0±0.6 |
注：与正常组比较P＜0.05，与过敏性非哮喘组比较△P＜0.05
表3 四组患者PBMC和BAL细胞培养液中CD+4、CD+25百分数分析(x±s)
| 组别 |
例数 |
PBMC |
BAL |
| M |
HDM |
M |
HDM |
| 过敏性哮喘组 |
12 |
7.9±2.9 |
8.6±2.5△ |
9.8±1.8△△ |
11.5±4.3△ |
| 非过敏性哮喘组 |
10 |
7.4±2.7 |
7.1±2.3 |
10.4±2.6△△ |
8.1±2.5 |
| 过敏性非哮喘组 |
9 |
7.0±2.4 |
8.0±2.5△△ |
8.3±2.1 |
9.4±1.2△ |
| 正常对照组 |
10 |
6.1±2.5 |
6.0±2.3 |
6.6±1.9 |
6.4±1.8 |
注：M：仅以RPMI-1 640培养，HDM：屋尘螨(10 g/L)；与非哮喘组比较P＜0.05，P＜0.01；与正常组比较△P＜0.05，△△P＜0.01
表4 四组患者PBMC和BAL细胞培养上清液中IL-5水平测定(x±s)
| 组别 |
例数 |
PBMC(μg/L) |
BAL(μg/L) |
| M |
HDM |
M |
HDM |
| 过敏性哮喘组 |
12 |
74±28△△ |
143±63△△ |
38±13△△ |
69±14△△ |
| 非过敏性哮喘组 |
10 |
80±29△△ |
86±42 |
82±15△△ |
41±13 |
| 过敏性非哮喘组 |
9 |
0±151 |
102±11△ |
4±4 |
… |
| 正常对照组 |
10 |
0±52 |
17±10 |
… |
… |
注：M：仅以RPMI-1 640培养，HDM：屋尘螨(10 g/L)；与非哮喘组比较：P＜0.05，P＜0.01，与正常组比较△P＜0.05，△△P＜0.01
三、细胞培养液测定
PBMC和BAL细胞培养液中CD+4、CD+25百分数，见表3。
四、IL-5水平测定
PBMC和BAL细胞培养上清液中IL-5水平测定,见表4。
其中BAL细胞释放IL-5水平与EOS％显著相关(AA组r＝0.617，P＜0.05；NAA组r＝0.842，P＜0.01)。PBMC培养，CD+4、CD+25细胞数与IL-5水平相关(AA组r=0.644,P＜0.05;AN组r=0.845,P＜0.01)。
讨论
本组研究中，哮喘组患者(过敏性和非过敏性)在基础情况下，通气功能(FEV1％)下降，气道反应性(组胺PC20)增高；BAL液中EOS和中性粒细胞百分比增高。说明哮喘组患者持续存在气道炎症。与此相一致的是,两哮喘组BAL细胞在无抗原刺激下培养，CD+4、CD+25细胞数增高，IL-5释放水平增高。说明CD+4T细胞活化和IL-5释放增高是过敏性和非过敏性哮喘的共同特征。
PBMC在无抗原刺激下培养，CD+4、CD+25细胞在4个受试组间无明显差异。而两过敏症组（过敏性哮喘和过敏性鼻炎与过敏性结膜炎）PBMC在抗原刺激下培养,CD+4、CD+25细胞数以及IL-5释放均高于非过敏症组和正常对照组；而BAL细胞在抗原刺激下培养,只有过敏性哮喘组IL-5释放增高并伴有EOS％增高。过敏性非哮喘患者BAL细胞基本上没有自发产生IL-5的能力。以上观察揭示,特异性过敏原刺激是过敏症患者CD+4T细胞活化的IL-5释放增高的重要原因。与过敏原持续接触，CD+4T细胞的持续活化是过敏性哮喘气道炎症慢性化的基本原因。BAL细胞释放IL-5的能力与哮喘状态有关，也与过敏状态有关。气道细胞产生IL-5量上的差别有可能用以判定过敏症患者临床上是否存在哮喘。Lopez等［8］报道，有症状但稳定的哮喘患者其支气管活检标本和BAL液中活化的CD+4T细胞升高。非过敏性哮喘患者气道内CD+4T细胞的活化，可能是迄今尚未确定的、内源性抗原物质刺激的结果。
我们发现，两过敏症组PBMC在抗原刺激下培养，CD+4、CD+25细胞数增高与IL-5水平增高具有相关性，但此种相关性在BAL细胞培养却反映不出来。这种T细胞对过敏原反应的不同,可能是其它细胞特别是存在于BAL细胞培养中的肺泡巨噬细胞参与的结果。 以往有过报道，肺泡巨噬细胞可促进肺内过敏原特异性T细胞反应［9］，这种T细胞微环境中许多不同因素可以影响细胞因子的产生。
参考文献
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5Kay AB, Ying S,Varney V,et al.Messenger RNA expression of the cytokine gene cluster, IL-3, IL-4, IL-5 and GM-CSF in allergen-induced late-phase reactions in atopic subjects. J Exp Med,1991,173：775-778.
6Durham S, Ying RS, Varney VA, et al.Cytokine messenger RNA expression for IL-3,IL-4,IL-5 and grannulocyte/macrophage colony-stimulating factor in the nasal mucosa after local allergen provocation：Relationship to tissue eosinophilia. J Immunol,1992,148：2390-2394.
7Sun Y, Durham SR,Barkans J, et al.T-cells are the principal source of interlenkin-5 mRNA in allergen-induced rhinitis. Am J Respir Cell Mol Biol,1993,9：356-360.
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9Gant V, Cluael M, Shakoor Z,et al.Alveolar macrophage accessory cell function in bronchial asthma. Am Rev Respir Dis,1992,146：900-904.
(收稿：1998-02-12 修回：1998-05-22)
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