VEGF免疫组化染色在冠心病猝死诊断中的应用

法医学杂志 2000年第1期第16卷 论著

作者：陈建国　徐小虎　姚青松　汪冠三　祝家镇

单位：陈建国（中山医科大学法医病理学教研室，广东广州　510089）；徐小虎（汕头大学医学院病理学教研室，广东汕头　515031）；姚青松（广州市公安局刑科所，广东　510030）；汪冠三（广州市公安局刑科所，广东　510030）；祝家镇（中山医科大学法医病理学教研室，广东广州　510089）

关键词：冠心病猝死；血管内皮生长因子；免疫组织化学

　　［摘要］运用免疫组化SABC法和图像分析与统计学处理系统，对16例冠心病猝死和15例非冠心病猝死对照组尸检心脏标本心肌局部血管内皮生长因子（VEGF）的表达进行了研究。结果：16例冠心病猝死心脏标本心肌梗死局部心肌均有VEGF的阳性表达，尤以心肌梗死灶边缘为甚，阳性表达率为100％。15例非冠心病猝死对照组心脏标本仅有2例心肌局部散在有VEGF弱阳性表达，其余为阴性。将免疫组化染色结果进行图像定量分析与统计学处理，冠心病猝死组阳性指数为13.68±2.73，对照组为2.05±0.84，两组结果有极显著性差异（P＜0.01）。本研究结果提示，VEGF免疫组化染色可望为冠心病猝死的死后诊断提供一个比较客观的病理形态学依据。

　　［中图分类号］DF795.1　［文献标识码］A

　　［文章编号］1004－5619(2000)01－0006－02

Immunohistochemical studies on vascular endothelial growth factor (VEGF) for the postmortem diagnosis of sudden coronary death

Chen Jianguo, et al.

　　(Department of Forensic Pathology,Sun Yat－ sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,P.R.China)

　　The expression of VEGF in myocardium of the heart of sudden coronary death (SCD; n=16) and of the control group (n=15) was studied quantitatively by immunohistochemistry SABC method, image analysis and statistical process. The results showed that local infarcted myocardium of the heart from all SCD had strong positive expression of VEGF, especially in peri－ infarction area. The rate of positive expression was 100％ , while only two of the 15 in control group had mild positive expression sparsely in local myocardium. Image analysis and statistical process showed that the positive index in SCD group was 13.68± 2.73, and in the control group 2.05± 0.84. There was a significant difference between the two groups (P＜ 0.01). The results suggested that the immunohistochemical staining of VEGF with image analysis and statistical process be used as an objective marker for the postmortem diagnosis of SCD.

　　Key words: sudden coronary death;vascular endothelial growth factor;Immunohistochemistry

　　冠心病猝死（SCD）是法医检案中最常见的死因之一，常规病理学方法可以发现冠状动脉粥样硬化以及新鲜血栓形成，但难以发现心肌细胞的特异性缺血改变，同时由于冠状动脉粥样硬化又是其他原因死亡者尸检时常见的病变^［1］，故其心肌缺血后的改变及其病理学诊断仍是法医病理学的一大难题。

　　血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor;VEGF）是一种强烈的特异的血管内皮细胞促有丝分裂剂和促血管生成因子，缺血和缺氧能强烈诱导其在缺血缺氧组织局部表达^［2,3］。本研究首次应用免疫组化技术对SCD者心肌局部VEGF的表达进行了研究，旨在探索一种对SCD特异性强的死后诊断指标。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　31例心脏标本来源于广州市刑科所和本教研室1993～1998年间的尸检案例，其中SCD16例（实验组），非SCD15例（对照组）。VEGF一抗购自美国SantaCruz公司，免疫组化SABC试剂盒购自武汉博士德公司，DAB购自DAKO公司，图象分析处理系统Quantimet－520为英国剑桥公司产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1　取材、制片

　　31例心脏标本每例取心尖部之左室前壁和侧壁各一块，10％福尔马林固定，常规石蜡切片，连切3张，厚4μm，分别作HE和VEGF免疫组化染色。

　　1.2.2　VEGF免疫组化染色

　　VEGF一抗工作浓度为1∶100，免疫组化染色操作按SABC试剂盒说明书进行。PBS取代VEGF一抗作阴性对照。以心肌细胞膜或胞浆出现棕黄色产物为阳性结果，苏木素轻度复染细胞核。

　　1.2.3　图象分析及统计学处理

　　各组照片均应用英国Quantimet－520图象分析仪对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析，具体操作为低倍镜下找视野后，调至400×，自动控制装置随机选10个位点测量阳性反应产物面积，然后取平均值。阳性产物强度应用图像处理系统灰度值表示，从最大（1）到最小(256)共分为256个灰度层次，其灰度值愈大则阳性反应物的阳性强度愈小。为研究直观性和消除背景的影响，本研究将测得的灰度值进行以下转换；灰度值=背景灰度测量值－阳性物灰度测量值。然后将上述数值依据赵景民等［4］的改良方法转化成阳性指数：阳性指数=阳性反应面积/测量面积×阳性强度灰度值。所有数据应用SPSSforWindows软件包进行方差齐性检验和t检验等统计学处理。数据应用均数±标准差（±s）表示。

　　2　结果

　　2.1　一般情况(见表1)

表1　两组死者一般情况

　　从表中发现两组在年龄、性别组成、心脏重量以及死后至尸检时间等方面均无明显差异。

　　2.2　心脏肉眼检查结果

　　猝死组中冠状动脉粥样硬化管腔狭窄Ⅳ级7例，Ⅲ级4例，Ⅱ级3例，Ⅰ级2例。每例冠状动脉左前降支或/和左旋支或/和右冠状动脉均有不同程度的局灶性或广泛性病变，其中并发新鲜血栓形成3例，斑块内出血7例，陈旧性心肌梗塞2例，急性合并陈旧性心肌梗死3例。对照组15例中颅脑损伤致死11例，肝脾破裂失血性休克致死2例，缢死1例，电击死1例。15例中仅有4例轻度冠状动脉粥样硬化管腔狭窄(Ⅰ级)。

　　2.3　HE染色结果

　　SCD组16例中14例检见明显梗死灶，表现为心肌凝固性坏死以及炎细胞浸润，其中5例伴陈旧性梗死灶；余2例见局灶性胞浆伊红染色增强。对照组15例均未检见心肌明显缺血性病变。

　　2.4　SABC－VEGF免疫组化染色结果

　　SCD组16例心脏心肌梗死区及其周围区域大部分心肌细胞、血管内皮细胞和白细胞内出现VEGF强阳性染色（图1），尤以梗死灶周围区域为甚（图2）。阳性表达率为100％。

图1　SCD组心肌梗死区及其周围区域大部分心肌细胞、血管内皮细胞以及

　　白细胞膜出现VEGF阳性染色SABC×200

图2　SCD组心肌梗死周围区心肌细胞VEGF强阳性染色SABC×200

　　对照组15例中仅2例检见少许心肌细胞和血管内皮细胞胞浆弱阳性染色，其余均为阴性（图3）。

图3　对照组心肌细胞和血管内皮细胞阴性染色SABC×200

　　2.5　图像分析与统计学处理结果

　　两组SABC－VEGF免疫组化染色经图像定量分析与统计学处理，猝死组阳性指数为13.68±2.73，对照组阳性指数为2.05±0.84。t值为2.91，P值＜0.01，两组相比有极显著差异。

　　3　讨论

　　VEGF是近年来发现的一种具有高度特异性的、强烈的血管内皮细胞促有丝分裂剂和血管生成因子，组织的缺血和缺氧是诱导其表达上调的强烈因素之一^［2］。冠心病导致心肌缺血缺氧时，局部心肌会迅速产生大量的VEGF，并在一定程度上与心肌缺血缺氧的持续时间一致^［3,5］。

　　本研究首次应用SABC法对SCD和非SCD对照组心肌局部VEGF的表达情况进行了检测，结果发现:SCD组所有心脏均在梗死区域及其周围区域心肌出现VEGF阳性表达，特别以梗死灶周围区域表达更强烈，其原因是（1）冠状动脉狭窄后导致所支配区域心肌血供减少，诱导心肌产生VEGF。（2）随着缺血时间的延长，缺血区域心肌细胞发生不可逆损伤，导致合成VEGF的能力下降，而VEGF蛋白表达越来越局限于缺血边缘区域的现象可能正好与此区域新血管的生成有关^［5］。此外还因为缺血边缘区域存在氧梯度以及局部存活的心肌细胞较梗塞区域多，促使局部存活细胞合成VEGF以促进新血管的生成，而一旦氧梯度消失，则新血管的生成也会停止^［6,7］，局部VEGF的浓度也会下降，一般当局部缺氧缺血组织恢复血供和氧供时，VEGF会很快降至正常水平（24小时内）^［8］。而对照组仅有两例局部少许心肌出现VEGF弱阳性染色，经图像分析处理发现两组有极显著性差异。我们认为VEGF免疫组化染色对诊断心肌缺血有重要意义，它可为因心肌缺血所致的心脏性猝死提供客观的形态学依据。可望以一种简便、快速、敏感而又有高度特异性的诊断早期心肌缺血的方法运用到法医学检案中。

　　参考文献:

　　［1］陈新山.冠心病猝死的病理学研究—附128例尸检分析［J］.中国法医学杂志,1991,6(3):152－154.

　　［2］ Sheweike D, Hin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia－ initiated angiogenesis［J］.Nature, 1992,359:843－ 845.

　　［3］ Ladoux A, Frelin C. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mRNA expression in the heart［J］.Biochem Biophys Res Commun, 1993,195:1005－1010.

　　［4］赵景民,翟为溶,张月娥,等.肝细胞癌整合蛋白α5β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达［J］.中华病理学杂志,1997,26:65－69.

　　［5］ Li J, Brown LF, Hibberd MG, et al. VEGF, flk－ 1, and flt－ 1 expression in a rat myocardial infarction model of angiogenesis［J］. Am J Physiol, 1996,270:H1803－ H1811.

　　［6］ Knighton DR, Silver IA, Hunt TK. Regulation of wound－ healing angiogenesis－ effect of oxygen gradients and inspired oxygen concentration［J］. Surgery, 1981,90:262－ 270.

　　［7］ Dor Y, Keshet E. Ischemia－ driven angiogenesis［J］.Trends Cardiovasc Med, 1997,7:289－ 294.

　　［8］ Gu JW and Adair TH. Hypoxia－ induced expression of VEGF is reversible in myocardial vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol. 1997,273:H628－ H633.

(收稿日期：1998－12－17)