冠心病和脑梗塞患者载脂蛋白B基因多态性研究
中华心血管病杂志 1999年第1期第27卷 流行学与人群防治
作者：顾云 王绿娅 吴桂贤 王薇 刘静 秦兰平 刘军 吴兆苏
单位：100029 北京心肺血管疾病研究所 首都医科大学附属安贞医院
关键词： 载脂蛋白B类；基因；冠状动脉疾病；脑梗塞
【摘要】 目的 观察apo B基因3′VNTR多态性在北京地区汉族人群、冠心病患者及脑梗塞患者中的分布特点，进一步探讨其与血脂变量的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）扩增技术, 选择430例个体，其中冠心病组125例，脑梗塞组127例，健康对照组178例。结果 在430例个体中共分离到12个3′VNTR等位基因。对照组中以HVE32分布频率（41.0%）最高，冠心病组及脑梗塞组中以HVE34分布频率最高，分别为51.6%及55.9%, 冠心病组中串联重复拷贝数目大于等于40的等位基因分布频率高于对照组（P＜0.05)， 同时冠心病组及脑梗塞组中大于等于42的等位基因也较对照组增多(P＜0.05)。结论 apo B基因3′VNTR大等位基因的检出可能在一定程度上为揭示apo B基因在冠心病和脑梗塞脂质代谢中的作用提供了很好的遗传标记。
Polymorphism of the apolipoprotein B gene in patients with coronary heart disease and atherosclerotic cerebral infarction GU Yun, WANG Lüya, WU Guixian, et al. Beijing Institute of Heart, Lung and Blood Vessel Diseases, Beijing 100029
【Abstract】 Objective To investigate the polymorphism of variable number of tandem repeats (VNTR) 3 of the apolipprotein B (apo B) gene in patients with coronary heart disease (CHD) and atherosclerotic cerebral infarction (ACI) in Beijing area, and evaluate the association of polymorphism of 3′VNTR with level of blood lipid. Methods Using the polymerase chain reaction (PCR), the polymorphism of 3′VNTR was studied in 125 patients with CHD and 127 patients with ACI and 178 age-matched healthy individuals.Results Twelve segregating alleles of variable number of tandemly repeated loci of the 3′flanking region were observed. The most common allele was HVE32 in control group (41.01%) and HVE34 in CHD group (51.6%), ACI group (55.91%). Similarly, in CHD group and ACI group had frequency of 3′VNTR-B allele (number of repeat units≥42) was much higher than that in control group (P＜0.05).Conclusion It is suggested that 3′VNTR allele might be a marker of heredity in the development of CHD and ACI presumably through their influences of lipid metabolism.
【Key words】 apolipoproteins B gene cardiovascular disease cerebral infarction
动脉粥样硬化性心脑血管病在我国已成为严重威胁人民健康的主要疾病。在形成动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的各因素中，血脂代谢异常起重要作用。近年来，随着分子生物学技术和分子流行病学的发展，从基因和分子水平探讨载脂蛋白B基因多态性与动脉粥样硬化性心脑血管病的关系，已成为心血管疾病研究的重要课题。
近年来，多数研究认为载脂蛋白AI(apolipoprotein AI, apo AI)、载脂蛋白B(apo B)是指示冠状动脉粥样硬化风险度的良好指标［1］，国内外有学者开展血浆中apo AI, apo B含量及apo B基因多态性与AS、冠心病、心肌梗塞等疾病关系的研究，但其与动脉粥样硬化性脑梗塞(atherosclerotic cerebral infarction, ACI)的关系尚少报道。我们应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增技术，对apo B基因3′端可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats, VNTR）多态性在北京地区汉族人群，冠心病及脑梗塞患者中的分布特点及与血脂代谢各临床表现型的关系进行了对照研究，以期了解apo B基因3′VNTR与动脉粥样硬化性心脑血管病的关系。
对象与方法
一、研究对象选择和标准
1. 病例来源: (1)病例选自世界卫生组织心血管病监测方案(WHO MONICA——Beijing )冠心病和脑梗塞发病登记的回访病人及部分医院因急性心肌梗塞（恢复期）和脑梗塞（恢复期）的住院病例。(2)对照组选自国家“九*五”科技攻关项目人群，按照(WHO MONICA)方案危险因素调查标准［2］，从随机调查样本中收集体检健康人，血脂正常，排除心脑血管病、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病者。
2. 病例选择标准: 冠心病诊断符合世界卫生组织确定的诊断标准［3］，脑梗塞诊断按照全国第二届脑血管病学术会议修订的脑血管病诊断标准［4］，全部病例均经临床诊断和头颅CT扫描确诊。排除肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病。
3. 分组: (1)冠心病组：125例患者，男114例，女20例，平均年龄(52.1±10.2)岁；(2)脑梗塞组：127例患者，男106例，女41例，平均年龄(53.0±14.0)岁。(3)健康对照组：178例，男120例，女58例，平均年龄(48.8±11.4)岁。
二、方法
1. 血脂类检测：空腹12～14小时后，周围静脉取血5ml，用2%乙二胺四乙酸1:9抗凝，室温下离心10分钟，取上层血浆测定脂质及载脂蛋白，血细胞用于提取染色体DNA。 胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)采用氧化酶法测定；高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)用磷钨酸镁法；低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)采用Fridewald公式计算； apo AI, apo B100为透射免疫比浊法。
2. 染色体DNA提取及扩增：将抗凝血按照低渗溶解红细胞方法提取基因组DNA。 采用PCR技术特异性扩增apo B基因多态性位点片段：3′端可变数目串联重复序列(3′VNTR)。引物参照文献［5］设计，由中国医学科学院基础所医学分子生物学国家重点实验室提供。
3. apo B基因3′VNTR等位基因长度的判定：取12μl PCR扩增产物以2%的琼脂糖凝胶电泳（70V，3～4小时）分离，以PBR 322/MSPI为标准分子量，紫外检测仪中观察结果并照像。测量每一条带至加样孔的泳动距离，在半对数坐标纸上绘出标准分子量曲线，根据此标准曲线找出同一排加样孔的样品分子量，计算如下式：
串联重复序列拷贝数=（片段bp-151 bp)/15 bp
所得串联重复序列拷贝数即为等位基因，不同的等位基因可以组合成不同的基因型。采用Ludwig等［6］命名法，以偶数命名（n=15 bp重复数）等位基因，由此可得到多种等位基因型。
4. 统计分析: 统计分析采用SPSS软件包。对组间等位基因频率差异用χ2检验。对不同基因型亚组间血脂载脂蛋白水平的差异分别用t检验及单因素方差分析。
结果
一、冠心病组、脑梗塞组与对照组间血浆脂质及载脂蛋白水平比较
冠心病、脑梗塞组与对照组比较TC、TG、LDL-C、apo B升高(P＜0.001), HDL-C、apo AI 降低(P＜0.001), apo AI/apo B100比值下降(P＜0.001)。达到统计学的显著意义(表1)。
表1 对照组与冠心病组及脑梗塞组血浆脂质及载脂蛋白水平比较(
±s)
| 参 数 |
对照组 |
冠心病组 |
脑梗塞组 |
P值 |
| 年龄(岁) |
48.8±11.4 |
52.1±10.2 |
53.0±14.0 |
＞0.05 |
| TC(mmol/L) |
4.3±0.6 |
5.4±2.0 |
4.9±1.3 |
＜0.001 |
| TG(mmol/L) |
0.8±0.2 |
1.4±0.9 |
1.4±1.0 |
＜0.001 |
| LDL-C(mmol/L) |
2.6±0.7 |
3.8±1.1 |
3.2±1.2 |
＜0.001 |
| HDL-C(mmol/L) |
1.4±0.3 |
1.0±0.3 |
1.1±0.4 |
＜0.001 |
| apo AI(g/L) |
1.1±0.4 |
1.0±0.3 |
0.9±0.3 |
＜0.001 |
| apo B100(g/L) |
0.7±0.2 |
0.8±0.2 |
0.8±0.2* |
＜0.001 |
| apoAI/B100(g/L) |
1.5±0.4 |
1.1±0.3 |
1.1±0.3 |
＜0.001 |
注：与对照组比较，*P＜0.05，表2同
二、冠心病组、脑梗塞组与对照组apo B基因3′VNTR等位基因频率分布比较
本实验中，3′VNTR两个最常见等位基因HVE32(hypervariable element, HVE)在冠心病组、脑梗塞组和对照组中出现的频率依次为31.6%、30.7%及41.0%；HVE34分别为51.6%、55.9%及30.3%。此外，还对等位基因分组进行分析，发现大等位基因(HVE42～48)无论在冠心病组，还是在脑梗塞组其分布频率均明显高于对照组（P＜0.05），而大等位基因(HVE 40～48)在冠心病组中的分布频率明显高于对照组(P＜0.05)（表2）。
表2 对照组与冠心病组及脑梗塞组间apo B基因3′VNTR等位基因频率分布比较
| 等位
基因 |
对照组 |
冠心病组 |
脑梗塞组 |
| 例数 |
频率(%) |
例数 |
频率(%) |
例数 |
频率(%) |
|
20 |
2 |
0.6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| 28 |
19 |
5.3 |
3 |
1.2 |
0 |
0 |
| 30 |
24 |
6.7 |
10 |
4.0 |
9 |
3.5 |
| 32 |
146 |
41.0 |
79 |
31.6 |
78 |
30.7 |
| 34 |
108 |
30.3 |
129 |
51.6 |
142 |
55.9 |
| 36 |
34 |
9.6 |
13 |
5.2 |
12 |
4.7 |
| 38 |
12 |
3.4 |
3 |
1.2 |
2 |
0.8 |
| 40 |
5 |
1.4 |
3 |
1.2 |
1 |
0.4 |
| 42 |
5 |
1.4 |
6 |
2.4 |
5 |
2.0 |
| 44 |
1 |
0.3 |
4 |
1.6 |
3 |
1.2 |
| 46 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0.4 |
| 48 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0.4 |
| 亚组 |
|
|
|
|
|
|
| ≥38 |
23 |
6.5 |
16 |
6.4 |
13 |
5.1 |
| ≥40 |
11 |
3.1 |
13 |
5.2* |
11 |
4.3 |
| ≥42 |
6 |
1.7 |
10 |
4.0* |
10 |
3.9* |
三、冠心病组、脑梗塞组与对照组 apo B基因3′VNTR多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系
1 . 冠心病组中apo B基因多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系：冠心病组中大等位基因（拷贝数大于等于38）与小等位基因（拷贝数小于等于36）比较，TC、 LDL均升高(P＜0.05 ) 而apo AI/apo B100显著降低(P＜0.05)(表3)。
表3 冠心病组、脑梗组及正常对照组中apo B基因多态性
与血浆脂质及载脂蛋白的关系
| 组别 |
VNTR-B |
VNTR-S |
P值 |
| 冠心病组 |
|
|
|
| TC(mmol/L) |
6.3±3.4 |
5.0±1.9 |
＜0.05 |
| TG(mmol/L) |
1.5±0.6 |
1.4±0.8 |
＞0.05 |
| LDL-C(mmol/L) |
4.8±2.4 |
3.5±1.7 |
＜0.05 |
| HDL-C(mmol/L) |
0.9±0.3 |
0.9±0.3 |
＞0.05 |
| apo AI(g/L) |
0.9±0.3 |
1.0±0.3 |
＞0.05 |
| apo B100(g/L) |
0.8±0.2 |
0.8±0.2 |
＞0.05 |
| apo AI/apo B100 |
1.0±0.3 |
1.2±0.3 |
＜0.05 |
| 脑梗塞组 |
|
|
|
| TC(mmol/L) |
3.9±1.1 |
4.2±0.7 |
＞0.05 |
| TG(mmol/L) |
1.3±1.0 |
1.1±0.6 |
＜0.05 |
| LDL-C(mmol/L) |
2.8±1.3 |
2.6±0.6 |
＞0.05 |
| HDL-C(mmol/L) |
0.9±0.2 |
1.0±0.3 |
＞0.05 |
| apo AI(g/L) |
0.8±0.3 |
0.8±0.2 |
＞0.05 |
| apo B100(g/L) |
0.7±0.2 |
0.7±0.2 |
＞0.05 |
| apo AI/apo B100 |
1.1±0.3 |
1.0±0.3 |
＞0.05 |
| 对照组 |
|
|
|
| TC(mmol/L) |
4.6±0.8 |
4.4±0.8 |
＞0.05 |
| TG(mmol/L) |
1.0±0.5 |
0.9±0.4 |
＞0.05 |
| LDL-C(mmol/L) |
2.9±0.7 |
2.7±0.8 |
＞0.05 |
| HDL-C(mmol/L) |
1.4±0.3 |
1.4±0.3 |
＞0.05 |
| apo AI(g/L) |
1.5±0.4 |
1.4±0.4 |
＞0.05 |
| apo B100(g/L) |
0.8±0.3 |
0.7±0.2 |
＞0.05 |
| apo AI/apo B100 |
1.4±0.4 |
1.9±0.5 |
＜0.01 |
注：VNTR-B：VNTR≥38；VNTR-S：VNTR≤36
2. 脑梗塞组中apo B基因多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系：脑梗塞组中大等位基因与小等位基因比较，TG显著升高(P＜0.05)，其它血浆脂质变化差异均无显著性(表3)。
3. 对照组中apo B基因多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系： 对照组中大等位基因与小等位基因比较，TC、 TG及LDL均有所增加，但无统计学意义。而apo AI/apo B100极显著降低(P＜0.01)（表3）。
讨论
目前认为，AS是一种多因素所致的疾病， 其发生与多种遗传和环境因素有关［7］，而AS 是冠心病、脑梗塞的共同发病基础。在形成AS的各因素中，血脂代谢异常起着重要作用，而其中apo B水平升高与冠心病、脑梗塞密切相关［8］。
apo B通过与细胞膜上的LDL受体结合，介导60%～70%的LDL代谢，LDL水平升高则加速动脉硬化的形成，因而，apo B对体内脂类转运和代谢以及维持体内恒定的血脂水平起到重要作用。由于apo B对含 apo B的脂蛋白的组装，分泌和分解过程至关重要，故其基因变异可能导致血浆中这些脂蛋白数量和性质的变化，引发某些疾病。
apo B基因3′VNTR是人类最具多态性的遗传位点之一。由于其具有高变性，在临床研究apo B基因位点的作用上已成为很有用的遗传标记。
apo B基因3′VNTR多态性对于冠心病易感性具有独立判别意义［9］。本实验结果发现3′VNTR大等位基因HVE42、HVE44、HVE46、HVE48在冠心病患者中占优势，与国内相关报道一致［10，11］。同时发现上述大等位基因在脑梗塞患者中亦占优势。
目前多数学者认为，apo B基因的一个或几个位点的微小变异（或缺陷）会引起个体血脂升高，最后导致动脉粥样硬化或冠心病［1］。国内有学者研究结果表明［9］，apo B基因3′VNTR不同等位基因具有调控基因表达的作用，HVE44大等位基因可上调细胞内的基因表达。推测带有HVE44的apo B基因的转录活性高于带有HVE36的apo B基因。本实验结果支持这一推测。
在HVR位点多态性与血脂变量是否相关的研究中，不论是在冠心病组、脑梗塞组或对照组中，不同基因型亚组间血脂，载脂蛋白水平均有不同程度的改变，并且差异有显著性。目前认为，动脉粥样硬化的发生和发展与血浆中的脂蛋白有密切关系。血浆脂蛋白中的不同载脂蛋白大多是在肝脏和小肠中合成的，载脂蛋白与脂质结合，以脂蛋白的形式存在于血浆中，因此，血浆脂蛋白的变化是全身脂质代谢的反映。大量流行病学调查证实，血胆固醇增高是导致动脉粥样硬化的一个主要原因。Matsuda等报道，脑梗塞患者血浆中TG水平显著增高。
目前已知apo AI约占HDL-C 60%～70%, 可激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，促进主动脉成纤维细胞中游离胆固醇的清除，酯化周围组织游离胆固醇并将其转入肝内代谢。 对防止外周组织脂质沉积有重要意义，apo AI与动脉粥样硬化呈负相关。apo B100的含量能精确地反映LDL的水平，约占LDL的90%以上，apo B100能将胆固醇导向外周组织引起动脉粥样硬化, 因此，apo B100的升高与动脉粥样硬化呈正相关。血浆中apo AI降低及 apo B100升高在冠状动脉疾病的研究中被反复强调。大量流行病学研究证实，在脑动脉粥样硬化的发生发展中apo B100起着重要作用。
本实验结果提示：apo B基因3′VNTR大等位基因的检出为进一步揭示apo B基因在冠心病及脑梗塞脂质代谢中的作用提供了很好的遗传标记。同时实验结果表明，带有大等位基因的个体较带有小等位基因的个体更易患血脂代谢异常性疾病，而这种现象在冠心病组中较脑梗塞组及对照组中似乎更为明显。
志谢 中国医学科学院基础医学研究所陈保生教授及薛红老师的热情帮助
本课题系北京市自然科学基金资助项目（No：7952004）
参考文献
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(收稿：1998-05-06 修回：1998-09-20)
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