人禽流感样品采集、运输和检测技术规范（试行）

　　一、标本的采集

　　(一)标本采集人员

　　医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《与禽流感病禽密切接触者个人防护指导原则（试行）》做好个人防护。

　　(二) 采集对象

　　禽流感病人，疑似病人，根据需要可采集病禽以及人禽流感密切接触者。

　　（三）标本采集种类和时限

　　1 采集标本的种类

　　疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清、粪便以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物、其它脏器。

　　2 采集标本时间

　　1）咽、鼻拭子或含漱液、粪便在发病的头3天采集。

　　2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集。

　　3）尸检标本尸检时采集。

　　3 标本的运送

　　采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70 ℃以下保存。无－70 ℃条件的需在－20 ℃冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。

　　4 标本采集的方法

　　4.1病毒分离标本

　　应采集发病后3天内相关标本进行分离病毒。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank's，Eagle's或水解乳蛋白液。在采样液中需加入抗菌素，抗菌素多用青、链霉素（1000U/ ml），庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ ml）和制霉菌素（终浓度为50ug/ ml）。主要的采集样本的方法有以下几种：

　　1）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。

　　2）咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。

　　3）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。

　　4）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5 ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程数次。洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。

　　5）漱口液：用10 ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液。

　　注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有洗液和含漱液中不应含有抗菌素。

　　6) 肺活检材料：肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。

　　7）粪便标本：采集10-20g粪便（或用塑料杆人造纤维头的肛拭子两支）放入含有10ml PBS或生理盐水无菌的50ml有螺旋盖的塑料瓶内，密封，4℃条件下立即送至有关实验室

　　4.2血清标本

　　血清标本应包括急性期和恢复期双份血清5～10ml。急性期血样应尽早采集，一般不晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2-4周采集。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，血清可在4℃存放一周，长期保存置-20℃。

　　二、标本包装、运送

　　1、禽流感病例（包括疑似禽流感病例）标本必须放在大小适合的带螺旋盖内的有橡胶圈的塑料管里（一级容器），拧紧。

　　2、将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。

　　3、直接在一级容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名，同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检表（见附表），连同一级容器封于塑料袋内。

　　4、将装标本的密封袋放入二级带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器内，拧紧盖，在容器上标明有关信息。

　　5、将二级容器摆放在专用运输箱内（或疫苗运输箱），放入冰排，然后以柔软物质填充，并密封。

　　1）同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个二级容器内。

　　2）二级容器要承受不少于95Kpa的压力，内衬具吸水和缓冲能力的物质。

　　3）若进行病毒分离，可将密封好的装有标本的一级容器直接 放入液氮运输罐内运输。

　　4）所有容器必须印有生物危险标注。

　　5）标本需由专人（2人）运送，不得邮寄，最好使用专车。

　　三、标本的接收

　　1.广州、深圳、佛山、韶关、汕头、云浮、湛江和珠海市疾病预防控制中心为本辖区内标本接收指定单位，并开展相关的实验室检测工作。对病毒分离物的血凝实验阳性和血清H5N1抗体阳性的标本连同送检表一起送省疾病预防控制中心进行复检。

　　2、广东省CDC负责其它地级市样本的接收和实验室检测工作。并对复核样本的检测、鉴定和上送国家流感中心。。

　　3、以上指定实验室实行24小时标本接收制。

　　四、病毒的检测和相关程序

　　1、病毒分离和鉴定

　　用组织培养（MDCK细胞）和鸡胚分离法，细胞和鸡胚培养物进一步用HA和HI实验鉴定（具体方法见《广东省流感监测工作规范》）。经HI实验（用H5抗血清）检测阳性者报送国家流感中心。经特异性H5 RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离及鉴定工作必须在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。

　　2、血清抗体检测

　　方法见《广东省流感监测工作规范》。

　　3、禽H5病毒核酸检测

　　对疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物采用RT-PCR的方法快速检测禽H5亚型流感病毒及排除工作。

　　4、微量中和试验

　　对部分疑似病例的急性期和恢复期的双份血清进一步做微量中和试验。该实验必须在生物安全Ⅲ级 (BSL-3级)实验室里操作。

　　五、检测结果的确认

　　1．各流感监测实验室对血凝实验（HA）阳性或H5血凝抑制试验（HI）阳性的标本，上送进行复核。

　　2．省CDC流感实验室对血凝（HA）阳性、H5血抑（HI）阳性、RT-PCR检测阳性、微量中和试验阳性的标本，上送国家流感中心复核检测及确认。

　　六、检测结果报告

　　一般情况下， 实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后48小时内出具RT-PCR检测报告，3～5天出具病毒分离培养结果，于分离到病毒后的3～5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3～5天后完成。

　　当实验过程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。

　　流感实验室检测中应注意的若干问题

　　1、初期病毒分离标本的处理可以在二级生物安全柜中进行；如标本确认为H5N1阳性后，此标本的有关实验应在P3实验室中操作。血清学实验操作二级生物安全柜中或生物安全二级实验室进行。

　　2、禁止在同一实验室，更不能在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。

　　3、禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。

　　4、接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70℃或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。

　　5、严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。

　　6、流感病毒在-20℃～-40℃时不稳定，故长期保存应在-70℃温度以下。

　　记者：陈广泰　林楚东

广东省卫生厅

2004.02.05