羟基喜树碱和topotecan对人卵巢癌细胞株体外作用的研究
中华妇产科杂志 1999年第9期第34卷 论著
作者：孙正怡 沈铿 许秀英 郎景和
单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科 100730
关键词：喜树碱；topotecan；卵巢肿瘤
【摘要】 目的 观察10-羟基喜树碱（羟基喜树缄）和9-二甲基氨基-10-羟基喜树缄（topotecan）对卵巢癌细胞株体外生长的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法，测定羟基喜树碱和topotecan对卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3生长的抑制作用，并绘制浓度-抑制率曲线，观察这两种药物对SKOV3和CAOV3的生长及集落形成的抑制作用，并与顺铂进行对比；用末端脱氧核酰转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）、DNA 梯形条带法检测药物诱导细胞凋亡的情况；免疫组化法检测药物对c-myc、bcl-2、fas基因的表达；并通过透射电镜观察应用羟基喜树碱后细胞超微结构的变化。结果 羟基喜树碱和topotecan对卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性；羟基喜树碱和topotecan对SKOV3作用24小时的50％抑制浓度（IC50）分别为72 ng／ml和160 ng／ml，对CAOV3作用24小时的10％抑制浓度（IC10）分别为141 ng／ml和12 ng／ml，均明显高于顺铂（P＜0.01）；羟基喜树碱和topotecan对细胞株的集落形成均有明显的抑制作用，与顺铂比较，差异均有极显著性（P＜0.01），且topotecan作用强于羟基喜树碱（P＜0.05）；5 ng／ml的羟基喜树碱和topotecan分别使SKOV3的倍增时间延长49.00倍和1.75倍，使CAOV3的倍增时间延长2.77倍和1.94倍，羟基喜树缄和topotecan明显抑制了SKOV3和CAOV3的生长（P＜0.05）；羟基喜树碱和topotecan均可诱导SKOV3和CAOV3凋亡，与对照组比较，差异均有显著性（P＜0.05）；羟基喜树碱和topotecan对SKOV3和CAOV3 的c-myc、bcl-2、fas基因表达的影响不明显（P＞0.05）；透射电镜观察发现，羟基喜树碱可导致SKOV3和CAOV3的细胞核、细胞器和微绒毛损伤。结论 羟基喜树碱和topotecan对卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3的生长有明显的抑制作用，并可诱导SKOV3和CAOV3凋亡；羟基喜树碱可以明显改变两种细胞的超微结构。
The Effect of Hydroxycamptothecin and Topotecan
to SKOV3 and CAOV3 in vitro
SUN Zhengyi, SHEN Keng, XU Xiuying, et al.
Peiking Union Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peiking Union Medical College, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To examine the effect of hydroxycamptothecin (HCPT) and topotecan, two kinds of derivative of camptothecin, to two ovarian cancer cell lines, SKOV3 and CAOV3.Methods Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) was used to establish the dose-effect curves. The ability of these two drugs to induce apoptosis of the two cell lines was determined by the method of terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and DNA Ladder. The morphological changes of the cells were observed by electronic microscope. Expression of c-myc, bcl-2, and fas was estimated by the immunohistochemical staining.ResultsThe inhibition of HCPT and topotecan to the growth of SKOV3 and CAOV3 was dose-dependent. 50% inhibiting concentration (IC50) of HCPT and topotecan to SKOV3 was 72 ng/ml and 160 ng/ml, respectively; IC10 of HCPT and topotecan to CAOV3 was 141 ng/ml and 12 ng/ml, respectively. The inhibition of HCPT and topotecan to clone forming rate of two cell lines was significant. The growing curves of SKOV3 and CAOV3 treated by HCPT and topotecan were significantly lower than controls. HCPT and topotecan of 5 ng/ml can elongate the double time of SKOV3 for 49.00 and 1.75 times, respectively. They can elongate the double time of CAOV3 for 2.77 and 1.94 times, respectively. After treated by HCPT or topotecan, SKOV3 generated DNA Ladder. Positive rates of TUNEL of SKOV3 and CAOV3 were elevated by HCPT and topotecan notably. HCPT and topotecan did not affect the expression of c-myc, bcl-2, fas of SKOV3 and CAOV3. Observed by electronic microscope, heterochromatin of SKOV3 and CAOV3 coagulated after treated by HCPT. Micro villi of SKOV3 and CAOV3 were damaged, and some vacuoles appeared in the cytoplasm.Conclusions HCPT and topotecan can inhibit growth of SKOV3 and CAOV3 significantly. HCPT and topotecan can induce apoptosis of SKOV3 and CAOV3.
【Key words】 Lamptothecin Topotecan Ovarian neoplasms
10-羟基喜树碱（羟基喜树碱）主要在我国应用于肝癌、胃肠道肿瘤、膀胱癌的治疗；而9-二甲基氨基-10-羟基喜树碱（topotecan）主要在国外应用于肺癌、卵巢癌，尤其是对顺铂治疗失败或复发的卵巢癌患者，有较好的治疗作用［1,2］。本研究以卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3为对象，研究羟基喜树碱和topotecan对这两种卵巢癌细胞株体外生长的影响及诱导这两种细胞凋亡的情况，并将这两种药物与顺铂进行了对比研究。现报道如下。
材料和方法
一、材料
1．卵巢癌细胞株：（1）SKOV3，来源于卵巢癌患者腹水，美国G.Trempe于1973年建立；（2）CAOV3，来源于卵巢癌患者肿瘤组织，为美国J.Frog于1976年建立。两种细胞株均由美国国立癌症研究所赠送我院妇科肿瘤实验室，本实验中发现细胞株CAOV3为顺铂耐药株。
2．试剂：四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司生产；原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Boehringer-Mannheim公司；抗c-myc蛋白抗体、抗bcl-2蛋白抗体、抗fas蛋白抗体，均为美国Santa Cruz公司生产，购自北京中山公司。
二、方法
（一）测定羟基喜树碱和topotecan对SKOV3和CAOV3生长影响的实验
1. MTT显微培养实验：以无菌操作技术分别配制浓度为0.244～64 000 ng/ml的羟基喜树碱、topotecan和顺铂的培养基，药物浓度以2倍递增。用以上浓度的含药培养基孵育细胞，分别在24小时和48小时时进行MTT快速比色，在酶标仪上以490nm的波长测定吸光度（A）值。抑制率＝［(对照组A值-实验组A值)/对照组A值］×100%。以浓度-抑制率曲线求出回归方程，得出50%抑制浓度（IC50）或10％抑制浓度（IC10）及最大抑制率、最大抑制浓度。
2. 集落形成实验：向8个25 cm2培养瓶中分别加入约200个SKOV3或CAOV3的细胞悬液，显微镜下精确计数细胞数后，再分别加入浓度为5 ng/ml的羟基喜树碱、topotecan、顺铂及不含药物的培养基各5 ml，培养7～10天后，计数集落的个数。集落形成率＝(集落数/种入的细胞数)×100％。
3. 细胞生长的测定：将SKOV3和CAOV3接种入96孔板中，每孔2×103个细胞，3个实验组的细胞分别用浓度为5 ng/ml的羟基喜树碱、topotecan和顺铂的培养基培养，对照组培养基不加药物。每组每天取4孔进行MTT快速比色，共8天，绘制细胞生长曲线，用曲线回归法计算倍增时间。
（二）透射电镜观察羟基喜树碱对细胞超微结构的影响
向对数生长期的SKOV3和CAOV3加入羟基喜树碱，浓度为30 ng/ml，24小时后，将细胞刮下，离心，用2.5％戊二醛1 ml固定细胞团。透射电镜观察细胞超微结构。
（三）细胞凋亡的检测
1. 特异性DNA梯形条带的检测：分别配制浓度为5～64000 ng/ml的羟基喜树碱、topotecan和顺铂的培养基，药物浓度以2倍递增，向对数生长期的细胞分别加入含药物的培养基，培养24、48小时，提取DNA 200 ng进行琼脂糖电泳，在300 nm波长的紫外灯下观察，以出现间隔180bp的DNA梯形条带为阳性。
2. 末端脱氧核酰转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测原位细胞凋亡：分别用浓度为30 ng/ml的羟基喜树碱和topotecan的培养基孵育对数生长期的SKOV3和CAOV3 24小时，再用TUNEL试剂盒中的混合试剂孵育细胞后显色，深蓝色细胞为凋亡细胞，计数原位细胞凋亡比例。
（四）羟基喜树碱、topotecan对肿瘤细胞c-myc、bcl-2和fas基因表达影响的实验
分别用浓度为30 ng/ml的羟基喜树碱和topotecan的培养基孵育对数生长期的SKOV3和CAOV3 24小时，应用免疫组化染色法检测c-myc、bcl-2和fas基因表达阳性率的变化，深褐色细胞为阳性细胞。
三、统计方法
检验浓度-抑制率曲线及细胞生长曲线，采用Logistic曲线回归法，F检验；检验药物对细胞集落形成率的作用，采用u检验；检验药物对细胞凋亡作用及其相关基因表达的影响，采用t检验。
结果
一、羟基喜树碱和topotecan对SKOV3和CAOV3生长的影响
用MTT比色法检测羟基喜树碱、topotecan和顺铂对SKOV3、CAOV3的作用，从浓度-抑制率曲线发现，浓度为0.244～32 000ng/ml的羟基喜树碱、topotecan和顺铂对SKOV3和CAOV3分别作用24、48小时，其抑制率均呈明显的剂量依赖性，药物的浓度-抑制率曲线呈“S”型，符合Logistic曲线，相关指数(R2)大于0.8，IC50或IC10值见表1。
表1 羟基喜树碱、topotecan和顺铂对SKOV3和
CAOV3作用的IC50或IC10(ng/ml)
| 类别 |
SKOV3 |
CAOV3 |
| 24小时 |
48小时 |
24小时 |
48小时 |
| 羟基喜树碱 |
72* |
18* |
141** |
65* |
| topotecan |
160* |
15* |
12** |
396* |
| 顺铂 |
4590** |
3276* |
60101** |
87635* |
注：*为IC50值 **为IC10值
羟基喜树碱和topotecan对两种细胞株分别作用24小时和48小时的浓度-抑制率曲线均明显高于顺铂，两者比较，差异有极显著性（P＜0.01）。见图1。
图1 羟基喜树碱、topotecan和顺铂对SKOV3作用24小时的
浓度-抑制率曲线
通过集落形成实验发现，浓度为5 ng/ml的羟基喜树碱和topotecan可以明显抑制SKOV3和CAOV3集落形成，分别与未加药物的对照组比较，差异均有极显著性（P＜0.01）；而浓度为5 ng/ml的顺铂对细胞株的集落形成没有抑制作用。topotecan抑制两种细胞株集落形成的作用均强于羟基喜树碱，两者比较，差异均有显著性（P＜0.05）。见表2。
表2 羟基喜树碱、topotecan和顺铂作用下SKOV3
和CAOV3的集落形成率（%）
| 类别 |
SKOV3 |
CAOV3 |
| 种入
细胞数 |
集
落数 |
集落
形成率 |
种入
细胞数 |
集
落数 |
集落
形成率 |
| 羟基喜树碱 |
183 |
38 |
20.8*△ |
255 |
26 |
10.2*△ |
| topotecan |
206 |
27 |
13.1*△ |
261 |
13 |
5.0*△ |
| 顺铂 |
140 |
112 |
80.0 |
204 |
69 |
33.8 |
| 对照组 |
192 |
158 |
82.3 |
252 |
88 |
34.9 |
* 与对照组比较，P＜0.01；△与顺铂比较，P＜0.01
检测羟基喜树碱、topotecan和顺铂对SKOV3和CAOV3生长的影响，从生长曲线发现，浓度为5 ng/ml的羟基喜树碱、topotecan和顺铂均可使SKOV3的倍增时间延长，分别延长49.00、1.75、1.34倍；羟基喜树碱、topotecan和顺铂也均可使CAOV3的倍增时间延长，分别延长2.77、1.94、1.58倍。加入羟基喜树碱、topotecan和顺铂的SKOV3和CAOV3的生长曲线明显低于未加药物的对照组细胞，分别比较，差异均有极显著性（P＜0.01）。羟基喜树碱和topotecan对两种细胞生长的影响明显大于顺铂，分别比较，差异均有显著性（P＜0.05）。见图2。
图2 5 ng/ml羟基喜树碱、topotecan和顺铂作用于SKOV3的
生长曲线
二、羟基喜树碱对SKOV3、CAOV3超微结构的影响
经浓度为30 ng/ml的羟基喜树碱培养基孵育24小时的SKOV3微绒毛明显减少；胞浆内出现大小不等的空泡；溶酶体数目增多，一些溶酶体裂解、外溢；细胞核电子透过度明显增高，核异染色质浓聚成小块状，并有部分向核周边聚集，形成凋亡小体；部分细胞核形态不规则，有“出泡”现象。CAOV3的线粒体明显肿胀，内脊模糊、破坏。
三、羟基喜树碱、topotecan和顺铂诱导SKOV3、CAOV3凋亡的情况
以浓度为10～30ng/ml的羟基喜树碱和topo- tecan及浓度为8 000～16 000 ng/ml的顺铂培养基孵育SKOV3 24小时，可产生特异性的DNA 梯形条带；以更高浓度的3种药物培养基孵育SKOV3 24小时，则产生膜状条带。而以3种药物培养基孵育CAOV3 24小时或48小时，均未产生DNA梯形条带。见图3。
1、4、7：顺铂，浓度分别为32 000、16 000、4 000 ng/ml 2、5、8：topotecan，浓度分别为60、30、5 ng/ml 3、6、9：羟基喜树碱，浓度分别为60、30、5 ng/ml 10：SKOV3对照组11：DNA相对分子质量标准(PBR322/Hinf I)
3 羟基喜树碱、topotecan和顺铂培养基孵育
24小时后产生的DNA梯形条带
TUNEL法检测发现，未经药物培养基孵育的SKOV3和CAOV3中有少量细胞发生凋亡，凋亡比例分别为14.0%、17.7%；而分别用羟基喜树碱和topotecan培养基孵育后的SKOV3的细胞凋亡比例为22.4%、21.9%，CAOV3的凋亡比例为38.7%、24.8%，较对照组明显增高（P＜0.05）。
四、羟基喜树碱和topotecan对SKOV3、CAOV3凋亡相关基因表达的影响
羟基喜树碱和topotecan培养基孵育后的SKOV3，其c-myc基因的表达稍增加，bcl-2基因的表达稍降低，fas基因的表达稍增加，但与对照组比较，差别均无显著性（P＞0.05）；羟基喜树碱、topo- tecan培养基孵育后的CAOV3的c-myc、bcl-2、fas基因的表达阳性率与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。
讨论
卵巢癌的一线化疗药物中，顺铂最为常用，但发生顺铂耐药的患者生存率明显降低，生存时间缩短，导致治疗失败。因此，为卵巢癌寻找有效的二线化疗药物是提高卵巢癌患者生存率的重要手段，有很大的临床意义。国外近年来发现，喜树碱类药物如topotecan和CPT-11等药物对顺铂耐药的卵巢癌患者有较好的治疗作用，认为topotecan适合作为顺铂耐药患者的化疗药物［3,4］。本研究证实，羟基喜树碱和topotecan对细胞株SKOV3和CAOV3的生长有明显的抑制作用，而且在实验中发现，细胞株CAOV3对顺铂是耐药的（顺铂对CAOV3的IC50为87 000ng/ml），但羟基喜树碱和topotecan对CAOV3仍有很强的抑制作用，说明topotecan和羟基喜树碱对耐顺铂的卵巢癌细胞有很好的抑制作用。本研究结果表明，羟基喜树碱和topotecan对卵巢癌细胞的抑制作用类似，但羟基喜树碱对细胞株的直接抑制作用稍强于topotecan，而对细胞集落形成的抑制稍弱于topotecan，这些研究结果为羟基喜树碱应用于临床提供了有力的证据。
细胞凋亡是通过基因调控的细胞自杀现象，在正常组织分化和肿瘤治疗中具有重要的意义，许多抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡达到的。我们应用检测DNA 梯形条带的方法，发现羟基喜树碱、topotecan和顺铂可以诱导SKOV3产生特异性的DNA 梯形条带，说明羟基喜树碱和topotecan在较低浓度时，即可诱导较多量的SKOV3发生凋亡；而应用TUNEL法发现，在未经药物培养基孵育的肿瘤细胞中存在少量的凋亡细胞，而用羟基喜树碱和topotecan培养基孵育后，两种细胞株凋亡的比例明显增加。实验中还发现，两种药物诱导SKOV3凋亡的作用强于CAOV3，说明在诱导凋亡方面，细胞间对药物的反应存在差异。同时，透射电镜观察发现，羟基喜树碱可以使细胞核异染色质浓聚，形成凋亡小体，也证实了羟基喜树碱可以诱导两种细胞株凋亡。以上结果说明，羟基喜树碱和topotecan对卵巢癌细胞株不仅有直接的抑制作用，而且还可以诱导这两种细胞株凋亡。
参考文献
1 Kudelka AP, Tresukosol D, Edwards CL, et al. Phase II study of intravenous topotecan as a 5-day infusion for refractory epithelial ovarian carcinoma. J Clin Oncol，1996, 14: 1552-1557.
2 Bokkel HW, Gore M, Carmichael J，et al. Topotecan versus paclitaxel for the treatment of recurrent epithelial ovarian cancer. J Clin Oncol，1997, 15:2183-2188.
3 Armstrong D. A phase II trial of topotecan as salvage therapy in epithelial ovarian cancer. Proc Am Aoc Clin Oncol, 1995, 14:275-280.
4 Dennis MJ, Beijnen JH, Grochow LB，et al. An overview of the clinical pharmacology of topotecan. Semi Oncol, 1997, 24(Suppl 5): 12-16.
(收稿：1998-10-22 修回：1999-06-24)
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