脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸对卵巢癌细胞的作用
中华妇产科杂志 1999年第8期第34卷 论著
作者：沈梅 丰有吉 葛柏青 吴直江 朱铭伟
单位：沈梅，丰有吉，葛柏青，朱铭伟 上海医科大学妇产科医院 200011；吴直江 中国科学院上海细胞生物学研究所
关键词：卵巢肿瘤；DNA；反义；基因；erbB-2；脂质体
【摘要】 目的 探讨脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸（脂质体-C-erbB2 S-ODNs）对卵巢癌细胞系C-erbB2癌基因表达及细胞增殖的影响。方法 应用流式细胞仪技术，3H-胸腺嘧啶核苷掺入方法，观察脂质体-C-erbB2 s-ODNs对卵巢癌细胞系SKOV3 C-erbB2癌基因表达及细胞生长、细胞周期的作用。结果 脂质体-C-erbB2 s-ODNs能够降低C-erbB2的表达，并抑制细胞生长；脂质体-C-erbB2S-ODNs降低细胞C-erbB2癌基因表达的作用效率较单用C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 s-ODNs)增强约40倍。结论 C-erbB2癌基因的反义调控在卵巢癌基因治疗中有一定作用；脂质体可有效增强C-erbB2 s-ODNs调控细胞C-erbB2癌基因表达的作用。
Effect of Liposome-C-erbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides on Human Ovarian Cancer Cells
SHEN Mei，FENG Youji，GE Baiqing，et al.
Gynecology and Obstetrics Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To explore the effects of liposome-C-erbB2 antisense phosphorothioate oligo deoxynucleotides（S-ODNs）on C-erbB2 protooncogene expression and cell proliferation in human ovarian cancer cells.Methods The effects on C-erbB2 protooncogene expression, cell proliferation and cell cycle in human ovarian cancer cells were studied by flow cytometry and 3H-thymidine incorporation.Results Liposome-C-erbB2 S-ODNs could reduce C-erbB2 expression and inhibit cell proliferation in human ovarian cancer cells； the effectiveness of liposome-C-erbB2 S-ODNs on the expression of C-erbB2 was much higher than that of C-erbB2 S-ODNs， about 40 times.Conclusions The data in this study suggest that antisense therapy is an useful method of gene therapy in ovarian cancer. The effectiveness of C-erbB2 S-ODNs could be greatly increased by C-erbB2S-ODNs encapsulated in liposomes.
【Key words】 Ovarian neoplasms DNA, antisense Genes, erbB-2 Liposomes
癌基因反义核酸调控，是一种较为有效的基因治疗［1，2］。目前，这方面的研究虽不断增多，但如何将反义核酸有效地导入癌细胞仍是亟待解决的问题。本研究应用脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(脂质体C-erbB2 s-ODNs），对人卵巢癌细胞SKOV3进行作用，探讨脂质体-C-erbB2 s-ODNs对卵巢癌细胞系C-erbB2癌基因表达及细胞增殖的影响。
材料及方法
一、材料
本研究所用卵巢癌细胞SKOV3由美国标准菌库提供。C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′，并经硫代磷酸修饰。脂质体由中国科学院上海生物化学研究所提供。C - erbB2单克隆抗体由美国Zymed Laboratories公司提供。RPMI 1640培养基为日本制药株式会社产品。流式细胞仪为FACS tar PLUS型，美国Becton Dickinson公司产品。β-液体闪烁计数仪（FJ-2107G型）为国营二六二厂产品。
二、方法
1. 脂质体-C - erbB2 S-ODNs的制备：将脂质体与C - erbB2 S-ODNs（质量比为10∶1）分别溶解于等体积无菌去离子双蒸水中，然后将两者混合，配成C-erbB2 S-ODNs浓度分别为0.125mg/L，0.25mg/L，0.5mg/L的溶液，于4℃中静置半小时以上［3］待用。
2. SKOV3细胞培养：将细胞浓度为5×107/L的SKOV3细胞，在37℃、5％二氧化碳条件下，于含10％小牛血清的RPMI 1640培养液中培养。24小时后，设对照组和实验组，对照组不予特殊处理。实验组又分为3种情况，SKOV3细胞分别用1.25 mg/L，2.5 mg/L、5 mg/L脂质体处理；SKOV3细胞分别用5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L C-erbB2 S-ODNs处理；SKOV3细胞分别用0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理。培养72小时后进行C - erbB2蛋白表达测定、细胞周期检测和3H-胸腺嘧啶核苷（3H -TdR）掺入实验。
3. C-erbB2蛋白表达测定：收集细胞约106个，加入C - erbB2鼠抗人单克隆抗体（1∶10稀释），4℃振荡45分钟后用磷酸缓冲液清洗，加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体，4℃振荡45分钟后再清洗。应用流式细胞仪分析C - erbB2蛋白表达强度。
4. 细胞周期测定：收集对照组细胞，将经20 mg/L C-erbB2 S-ODNs处理的细胞和经0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理的细胞，置于柠檬酸缓冲液1小时以上，调整细胞浓度为1×109个/L左右，离心后去掉上清液，加入1 800 μl胰酶消化液充分作用后，加入1 500 μl胰酶抑制液数分钟，再加入1 500 μl 碘化丙锭作用15分钟以上。应用流式细胞仪，进行DNA细胞周期分析。
5.3H -TdR掺入实验：细胞培养于96孔板，24小时后，对照组SKOV3细胞用1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L脂质体处理；实验组SKOV3细胞用0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理，72小时后，每孔加入0.5 μCr3 H-TdR培养18小时。最后，用细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β-液体闪烁计数仪测定放射性强度。
三、统计学方法
本研究采用t检验方法。
结果
一、脂质体-C - erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞C-erbB2蛋白表达的作用
实验组SKOV3细胞经不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs，C - erbB2 S-ODNs作用72小时后，C - erbB2表达均明显下降。与C - erbB2 S-ODNs的作用相比，脂质体-C - erbB2 S-ODNs的用量仅为C-erbB2 S-ODNs用量的1/40，而降低C - erbB2表达的作用也可增加。经不同浓度脂质体作用72小时后，C - erbB2表达与对照组比较，无明显改变。
二、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞周期的影响
SKOV3细胞分别经0.5 mg/L脂质体-C - erbB2 S-ODNs，20 mg/L C-erbB2 S-ODNs 作用72小时后，与对照组细胞周期比较，差异无显著性（P＞0.05）（表1）。
表1 不同细胞周期两组SKOV3细胞的改变*(%, 
±s)
| 细胞周期 |
对照组 |
实验组 |
| C-erbB2 S-ODNs
（20mg/L） |
脂质体-C-erbB2
S-ODNs
(0.5mg/L) |
| G0、G1 |
66.11±3.56 |
64.97±3.20 |
64.28±2.30 |
| G2、M |
16.94±3.34 |
17.97±2.49 |
20.39±5.53 |
| S |
16.95±2.80 |
17.10±2.74 |
15.32±5.03 |
*各细胞周期细胞占总细胞数百分比，两组比较，P＞0.05
三、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞生长的抑制作用
SKOV3细胞经不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs作用后，3H-TdR掺入率较单用脂质体均有下降（表2）。当浓度为0.25 mg/L时，两组比较，差异有显著性(P＜0.05)。
表2 不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs 对SKOV3 细胞
生长的影响*(±s)
| 脂质体浓度
(mg/L) |
每分钟脉冲数(cpm) |
细胞生长
抑制率(%) |
| 对照组 |
实验组 |
|
1.25 |
1 938.2±273.7 |
1 844.0±484.9 |
95.1±25.0 |
| 2.5 |
1 750.2±244.6 |
1 304.8± 27.6 |
74.6± 1.6 |
| 5 |
1 409.4±324.2 |
1 023.6±276.8 |
72.6±19.6 |
*以3H-TdR掺入量表示，两组比较，P＜0.05
讨论
随着分子生物学在卵巢癌领域研究的深入，已发现多种癌基因的异常表达与卵巢癌的生物学行为密切相关，有的与细胞转化有关，有的与细胞增殖有关，有的两者兼而有之，其中又以C - erbB2较为重要。不少研究表明，在20％～40％的卵巢癌细胞中存在C - erbB2基因的扩增和高表达，而且可能与卵巢癌的不良预后密切相关［4，5］。如何人为降低C-erbB2的高表达，从而改变卵巢癌的某些生物学表现，近年来，国内外学者都进行了一些有意义的探索［6，7］。
一、脂质体-C - erbB2 S-ODNs的反义调控作用及机理
反义调控，作为一种特异性封闭有害基因，使其不表达或低表达的手段，目前在肿瘤治疗研究中颇受重视，已有文献报道了癌基因的反义核酸对肿瘤细胞的抑制作用［1，7］。本研究选用C - erbB2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞系［8］，设计并人工合成了作用于C - erbB2 cmRNA 5′端编码区的反义脱氧寡核苷酸［9］，用硫代磷酸修饰后再用脂质体包裹。本研究结果表明，脂质体-C - erbB2 S-ODNs和C - erbB2 S-ODNs均能抑制SKOV3细胞C - erbB2 癌基因的表达，而前者的作用效率约为后者的40倍。
关于反义调控的机理，目前还不明确。根据反义寡核苷酸设计的不同，可能作用于蛋白表达过程中的不同环节。本研究所选用的C-erbB2 S-ODNs是与C - erbB2 cmRNA 5′端编码区互补的，是否通过反义寡核苷酸与癌基因DNA形成三螺旋结构而抑制了转录过程的进行，从而抑制了癌基因蛋白的表达［10，11］，还有待进一步的研究证明。
3H-TdR掺入实验选用脂质体组为对照组，是为了消除脂质体对细胞3H-TdR掺入率的影响，因为脂质体能够增加细胞对3H-TdR的吸收。本研究结果表明，脂质体-C - erbB2 S-ODNs可抑制SKOV3细胞生长，其抑制率约为30％，这与吴令英等［6］报道的结果相符。
二、脂质体对C - erbB2反义调控的增强作用及意义
目前，选择合适的导入系统仍是基因治疗中的一个难题。本研究所选用的脂质体，其表面带有正电荷，它能够与反义寡核苷酸通过静电引力结合，使反义寡核苷酸的包裹率达100％［3］。脂质体通过与细胞的融合和内吞作用，将C - erbB2 S-ODNs导入细胞中，这就增加了细胞的吸收。而且，因为有脂质体的包裹，而使C - erbB2 S-ODNs避免了与血清中核酸酶的直接接触，又可使C - erbB2 S-ODNs的稳定性提高。因此，降低细胞C - erbB2癌基因表达的作用效率较单纯用C - erbB2 S-ODNs增强了约40倍，大大减少了反义寡核苷酸的用量，有利于反义寡核苷酸的应用研究。
本课题受国家自然科学基金资助（基金编号：39470724）
参考文献
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(收稿：1998-08-30 修回：1999-05-12)
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