GST－π类同工酶基因在卵巢癌组织中的表达及其与癌变的关系

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第11期

王宏　李春海　陈高明　孙丽亚　卞丽红　杨毅　毛慧生

　　摘　要目的：检测GST－π基因在卵巢癌组织中的表达，探讨GST－π与卵巢癌癌变的关系。方法：采用免疫组化和RT－PCR方法，检测正常卵巢及卵巢良、恶性肿瘤组织中GST－πmRNA及蛋白水平的变化。结果：GST－π在卵巢组织中的表达与肿瘤的进展密切相关，即正常组织中GST－π几乎不表达，良性肿瘤中水平略有升高，交界性肿瘤多为低、中度表达，但阳性率明显升高，接近卵巢癌组织的水平。癌变组织则为中、高度表达且随临床分期的发展而逐渐增高。免疫组化与RT－PCR的结果符合率较高，但以RT－PCR法较为灵敏。结论：GST－π是与卵巢癌发生、发展密切相关的标志酶，它的表达异常与卵巢癌的预后有关。

　　关键词：GST－π　卵巢癌　免疫组化　RT－PCR

　　谷胱苷肽转移酶(glutathioneS－transferases，GSTs)主要包括α、μ、π等三类同工酶，参与机体的解毒功能。它们广泛分布于机体的各组织器官，但各亚类的分布具有器官特异性^[1]。其中，π类同工酶与人类肿瘤关系最密切。自从Sato等^[2]从大鼠化学致癌实验中推测GST－Pi是检测癌变“启动细胞”最早最灵敏的标志酶以来，与其相应的人GST－π与肿瘤的关系逐渐引起人们的重视，进而成为肿瘤学研究的热点之一。本文以卵巢癌手术切除组织标本为研究对象，采用RT－PCR和免疫组化方法，探讨GST－π基因在卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌发生发展的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　收集解放军总医院和解放军307医院的卵巢组织标本和石蜡切片139例，其中卵巢癌62例，交界性肿瘤7例，上皮来源良性肿瘤40例，正常卵巢30例，以上诊断均经病理科医生核实。

　　1.2　GST－π酶蛋白在卵巢癌组织中的表达

　　1.2.1　主要试剂和材料鼠抗人GST－π抗体由本室制备，ABC免疫组化试剂盒为美国Vector公司产品，购自北京中山生物工程公司。

　　1.2.2　方法采用标准ABC法^[3,4]。

　　1.2.3　结果判定ABC法中阳性反应产物为棕黄色，分布于胞膜和胞浆，依据阳性细胞数目和显色程度分为－、±、＋、＋＋、＋＋＋。具体评分按Shimizu方法，在高倍镜下对细胞着色进行观察。着色范围：无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫着色为3。将以上两项相加为最后结果，0为(－)，1为(±)，2为(＋)，3为(＋＋)，4为(＋＋＋)。

　　1.3　GST－π基因在卵巢癌组织中的表达

　　1.3.1　组织总RNA的提取采用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取总RNA^[4]，溶于适量DEPC处理的灭菌纯水中，RNA的定量与鉴定采用吸光度检测和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。

　　1.3.2　引物设计按照引物设计原则^[5]设计引物并将引物设计在不同外显子上。GST－π引物取自cDNA序列5′863～882bp，3′1192～1213bp，扩增片段350bp^[6]。β－actin基因引物取自cDNA序列5′346～367bp，3′558～580bp，扩增片段234bp^[7]。

　　1.3.3　反转录合成cDNA第一链取卵巢组织总RNA1μg，以oligo(dT)为引物，反应体系10μl，65℃作用10min后加入反转录酶MMLV200U，37℃作用60min，95℃作用5min，产物于－20℃保存。

　　1.3.4　PCR扩增10μl反应体系含10×PCR缓冲液1μl，反转录产物1μl，30pmol/L的GST－π及β－actin引物各1μl，TaqDNA聚合酶0.5U。阳性对照采用经测序鉴定的质粒，阴性对照以未经反转录的RNA代替cDNA模板，空白对照管未加TaqDNA聚合酶。反应在PE2400DNAThermalCycler上进行，条件如下：94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环后72℃作用7min，反应产物保存于4℃。

　　1.3.5　PCR产物定量分析取扩增产物5μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，KodakDigitalScience凝胶成像系统照相，1D软件定量分析各条带的含量。GST－π片段/β－actin片段的比值为基因表达的相对量，比值小于0.1为低度表达(＋)，比值介于0.1至0.4之间为中度表达(＋＋)，比值大于0.4为高度表达(＋＋＋)，目的基因无扩增条带为阴性。

　　2　结果

　　2.1　GST－π酶蛋白在卵巢肿瘤组织中的表达

　　正常卵巢组织中不表达GST－π；良性肿瘤阳性率为2.5％，阳性着色颗粒分布于胞浆和胞膜，Shimizu评分为3～4；交界性肿瘤阳性率明显高于良性者，为71％；卵巢癌GST－π酶蛋白颗粒亦分布于胞浆与胞膜，且多为＋＋＋或以上，阳性率高达75.8％，结合临床分期发现该酶蛋白的表达量与临床分期有关(P＜0.01)，提示预后不良(见图1、2，表1)。

图1　GST－π在卵巢癌组织中的表达ABC 10×20

图2　卵巢癌组织内GST－π的表达主要分布于胞浆及胞膜　ABC 10×40

表1　GST－π酶蛋白在卵巢组织中的表达

　　2.2　GST－π基因在卵巢肿瘤组织中的表达

　　PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后表现为，GST－π为350bp条带，内参基因β－actin为234bp条带。RT－PCR定量检测GST－π基因在卵巢组织中的表达结果见表2，经统计学分析，正常卵巢与良性肿瘤组织间该基因表达无明显差异，但在卵巢癌组表达显著升高(P＜0.05)。

表2　GST－π基因在卵巢组织中的表达

　　2.3　免疫组化及RT－PCR检测GST－π基因表达的比较

　　139例标本经免疫组化和RT－PCR检测GST－π基因的表达，统计学分析表明，两种方法有较高的一致性，尤其对于癌组织中GST－π基因表达的检测RT－PCR方法所得阳性率高于免疫组化值。RT－PCR方法与免疫组织化学法相比，具有特异性较强、快速、简便等优点。

　　3　讨论

　　肿瘤的发生是由于基因表达异常，引起蛋白质质和量的变化导致细胞生长、分化、死亡等生物学行为异常所致。GSTs作为一种重要的抗突变、抗肿瘤酶系在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。在卵巢肿瘤组织中GSTs的表达以GST－π为主，且从本文的实验结果来看，在良性病变发展到癌的过程中，GST－π的表达率逐渐增高，免疫组化的结果还发现GST－π的表达与临床分期有关(P＜0.05)，分期越高阳性表达越多，而临床分期越高预后越不好，因此提示GST－π的高表达与卵巢癌预后不良有关。

　　从理论上讲，理想的肿瘤标志物应具有100％的敏感性和100％的特异性，可到目前为止还没有一个肿瘤标志物能满足上述标准，GST－π的敏感性在卵巢癌组织中达到70％以上，达到了目前应用于临床肿瘤辅助诊断指标的一些肿瘤标志物的水平，但特异性较差，尚不能作为一个诊断性肿瘤标志酶。从方法上看，RT－PCR技术与免疫组化相比要简单、快捷且特异性强，尤其是通过对PCR产物的定量分析，更能客观地评价其表达程度和生物学意义。

　　GST－π酶蛋白在组织中的表达增高一般不外乎两种情况，一是蛋白合成量增加，二是由于蛋白质构象或结构变化导致半衰期延长。任何有功能的蛋白质都遵循这样的法则。而从蛋白质合成途径上看，一个有功能蛋白的合成一般要经历由基因到基因转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等过程。因此蛋白质的合成受多种因素多个水平的调节和控制，其中任何一个基本环节出现障碍，都将导致蛋白质的表达异常和功能变化。目前通过对人肿瘤细胞的研究初步认为，GSTs同工酶蛋白表达升高主要是由于基因mRNA转录水平增高所引起^[8,9]，也可能存在转录后及翻译后修饰机制^[10,11]。

　　*本文课题受国家自然科学基金资助　（编号　39570733）

　　作者单位：王宏　李春海　陈高明　孙丽亚　卞丽红　军事医学科学院基础研究所肿瘤分子生物学实验室　北京市100850

　　杨毅　毛慧生　天津市肿瘤医院分子生物学实验室

　　参考文献

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