TNF-α cDNA突变体在人膀胱癌细胞株EJ中的表达及作用
中华泌尿外科杂志 1999年第5期第20卷 论 著
作者：艾军魁 陈一戎 秦大山 孟筱琦 王兴民 王志平 白淑芳 刘国栋
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院泌尿外科
关键词： 膀胱肿瘤,癌,基因,转移
【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子TNF-α cDNA突变体对膀胱癌的作用。 方法 以突变的TNF-α cDNA为目的基因,pcDNA3.1(+)为载体,用磷酸钙沉淀法将其导入人膀胱癌细胞株EJ。 结果 PCR检测证实外源基因整合于EJ细胞内，放射免疫分析法检测转基因后细胞培养上清TNF-α表达量为(0.664±0.225)ng/ml,小鼠肉瘤细胞L929杀伤试验证实其生物活性为4～8U/ml，软琼脂培养细胞集落形成抑制率为36.5%。 结论 TNF-α cDNA突变体用于膀胱癌的基因治疗是可行的。
Expression and Function of TNF-α cDNA mutant in human bladder cancer EJ cell lines AI Junkui,CHEN Yirong,QIN Dashan,et al.Institute of Urology,Second Affiliated Hospital,Lanzhou Medical College,Lanzhou 730030
【Abstract】 Objective To study the function of a gene mutant of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in bladder cancer. Methods A TNF-α cDNA mutant was selected as the target gene.The novel mutant was transduced into human bladder cancer EJ cell lines with the plasmid pcDNA 3.1(+) as the vector by the method of calcium phosphate-DNA coprecipitation. Results Polymerase chain reaction (PCR) analysis confirmed the exogenic gene was stably integrated into EJ cell lines.The level of TNF-α in the supernatant collected from EJ cells transfected with TNF-α cDNA mutant was (0.664±0.225)ng/ml by radioimmunoassay (RIA) and L929 bioassay showed its cytotoxicity was 4～8U/ml.The formation ability of clony in soft agar was decreased significantly and the inhibition rate was 36.5%. Conclusions The TNF-α cDNA mutant can be used in gene therapy for bladder cancer.
【Key words】 Bladder neoplasms,Cancinoma,Gene,transfer
肿瘤坏死因子α(TNF-α)cDNAα突变体所产生的蛋白较天然型TNF-α具有高效低毒的特性[1]。我们将该突变体基因导入人膀胱癌细胞株EJ中，以观察其表达及作用。
材料和方法
一、突变型TNF-α重组体的构建
pcDNA 3.1(+)全长5.4kb,携带标记基因Neor,Ampr,pUCl8-TNF-α含目的基因人TNF-α cDNA突变体(474bp)。两种质粒均由兰州生物制品研究所惠赠。pUC18-TNF-α经EcoRI、XbaⅠ酶切分离出TNF-α cDNA片段,将其插入于pcDNA3.1(+)的EcoRI、XbaⅠ酶切位点之间,构建pcDNA3.1
(+)-TNF-α重组体，并经酶切分析证实。
二、膀胱癌细胞株EJ的转染
选取直径6cm平皿中70%满底的对数生长期EJ细胞，制备重组体DNA-磷酸钙共沉淀物[2,3],平皿中加入沉物0.5ml。培养、漂洗细胞，换MEM全培养基继续培养，24小时后加入G418选择性培养4天，G418浓度为600μg/ml，以200μg/ml维持筛选14天，新霉素抗性者为EJ/tnf。同法转染空载体pcDNA3.1(+)，抗性克隆为EJ/neo，设立未转基因EJ细胞作对照。
三、PCR检测外源基因
TNF-α cDNA突变体特异性引物，由卫生部兰州生物制品所惠赠，引物序列如下：P1,40bp,5′-GGAATTCCATGCGCAAACGTAAGCCTGTAGCCCATGTTGT;p2,24bp,5′TCAGAAGGCAAT
GATCCCAAAGTA，分别收集经重组体、空载体转染及未转染EJ细胞，提取DNA［2］，进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳。
四、细胞培养上清TNF-α分泌水平检测
TNF-α放免分析药盒购自中国原子能科学研究院。将EJ/tnf、EJ/neo、EJ三种细胞以106/瓶传代培养过夜，以无血清MEM漂洗3次，加入无血清MEM 3ml继续培养24小时。收集细胞培养液，按药盒说明检测。
五、细胞培养上清TNF-α活性检测［4］
采用小鼠肉瘤细胞L929杀伤试验，使L929细胞50%死亡的样品最大稀释倍数的倒数为一个活性单位。
六、细胞克隆形成试验——双层软琼脂培养
1.2%琼脂糖与2×DME 1∶1混合铺底，将单细胞悬液加入0.6%琼脂糖与2×DME 1∶1混合液中，取3ml加入已铺琼脂的平皿中，每平皿接种1 000个细胞。培养14天，计细胞集落数，计算克隆形成抑制率，公式如下：
100%
结 果
G418维持筛选3天，未转染对照细胞全部死亡，转染组于维持筛选18天后出现G418抗性克隆。以EJ/tnf全细胞DNA为模板，PCR扩增出符合TNF-α cDNA大小的基因片段，EJ/neo、EJ细胞均未扩增到该条带(图1)。EJ/tnf细胞培养上清中测到TNF-α的分泌且有生物活性。对照组细胞培养上清中无TNF-α表达，未测到生物活性。TNF-α cDNA突变体转染的细胞在软琼脂中生长，克隆形成率降低(表1)。
图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
1.DNA相对分子质量标准；2.阳性对照；3.EJ/tnf；4.EJ/neo；5.EJ；6.阴性对照
表1 TNF-α cDNA突变体在EJ细胞中的表达及对细胞集落形成的影响
| |
EJ |
EJ/neo |
EJ/tnf |
| TNF-α分泌水平(ng/ml M)* |
0 |
0* |
0.75** |
| TNF-α活性(U/ml) |
0 |
0 |
4～8 |
克隆形成数( ±s) |
64.5±6.45 |
62.3±2.08 |
41±7.07＃ |
| 克隆形成抑制率(%) |
对照 |
3.5 |
36.5 |
*数据经对数转换后行F检验 *：与EJ比较q=0.138,P＞0.05；**：与对照组比较,q=16.8,16.6,P＜0.01；＃：与EJ/neo比较q=6.33,P＜0.01讨 论
肿瘤细胞免疫源性下降或丢失，以及肿瘤患者免疫功能抑制，使肿瘤能够逃避机体免疫监视而恶性生长。肿瘤基因治疗的依据之一，就是提高肿瘤细胞免疫源性，解除肿瘤局部免疫抑制状态，达到治疗目的。
TNF-α在抗肿瘤免疫中有重要作用，但临床应用效果并不理想，原因有：(1)应用方式的限制，(2)细胞因子本身结构所决定的剂量依赖性毒副作用。基因疗法克服了因应用方式而产生的弊端。经一定修饰、改造的细胞因子，在提高生物活性的同时，毒副作用可显著下降［1］。1992年Rosenberg首次将TNF-α基因导入人黑色素瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞，并获得稳定表达。此后的研究表明，TNF-α能上调肿瘤细胞MHC Ⅰ、Ⅱ类分子、增强细胞免疫源性［5］，且能够增强免疫细胞功能，主要是CD4、CD8 T细胞免疫功能，诱导肿瘤排斥经基因瘤苗诱导后，淋巴细胞可活化为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，并粘附到靶细胞上释放细胞因子，攻击靶细胞［6,7］，是为肿瘤基因治疗的直接依据。
转基因肿瘤细胞分泌于细胞外的TNF-α对自身有直接抑制作用［8］。我们选择的TNF-α cDNA突变体，经DNA-磷酸钙共沉淀法能够在人膀胱癌细胞株EJ中稳定整合，外源基因在EJ能够持续分泌一定量且有活性的TNF-α，应有利于抑制EJ细胞的增殖；双层软琼脂培养证实，基因转染后EJ细胞集落形成率下降，此结果与文献报道相一致［9，10］。说明TNF-α cDNA突变体基因转染可以降低EJ细胞的恶性程度。本研究的方法和结论为膀胱癌的基因治疗提供了一定的依据，同时为临床上将特定修饰的新型基因用作目的基因进行肿瘤基因治疗展示了初步的应用前景。关于该突变体基因在原核细胞中表达后，具有高效低毒的优越性已被证实［1］，但TNF-α cDNA突变体与天然型对EJ细胞等真核细胞影响的比较还有待进一步研究。
参考文献
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2 金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第1版.北京：科学出版社，1992，788-790.
3 Kriegler M.Gene transfer and expression:A laboratory manual.New York:Stockton Press.1990,96-98.
4 Hwu P,Yanneli J,Kriegler M,et al.Functional and molecular characterization of tumor-infiltrating lymphyocytes transduced with tumor necrosis factor-α cDNA for the gene therapy of cancer in human.J Immunol,1993,150∶4104-4115.
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6 Asher AL,Mule JJ,Kasid A,et al.Murine tumor cells transduced with the gene for tumor necrosis factor-α.J Immunol,1991,146∶3227-3234.
7 Jin FS,Yu MS,Hui HX,et al.The mechanism of gene vaccine in anticancer.3rd Beijing International Symposium on Recent Advances in Urology.Beijing,1995,86.
8 Teng MN,Park BH,Koeppen HKW,et al.Longterm inhibition of tumor growth by tumor necrosis factor in the absence of cachexia or T-cell immunity.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88∶3535-3539.
9 Yannelli JR,Hyatt C,Johnson S,et al.Characterization of human tumor cell lines transduced with the cDNA encoding either tumor necrosis factor-α (TNF-α) or interleukin-2(IL-2).J Immunol Me-thods,1993,161∶77-89.
10 李鸣，顾方六，李万波，等.膀胱癌基因治疗的实验研究：外源肿瘤坏死因子α基因的表达及作用.中华泌尿外科杂志，1994，15∶415-418.
(收稿：1998-10-26 修回：1999-02-25)
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