大肠癌中MCC和APC基因突变检测及临床意义

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 大肠外科

作者：朱理玮　章志翔　王鹏志　苏延军　邱宇杰

单位：300052　天津医科大学总医院外科

　　关键词： 大肠癌；基因；突变

　　【摘要】　目的　研究大肠癌的发生机制。方法　采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析技术对大肠癌患者的肿瘤、正常组织及癌旁组织抑癌基因APC突变集中区MCR和抑癌基因MCC第10、12、15外显子的变化进行检测。结果　大肠癌及癌旁组织APC基因MCR 15G、15H、15I三段的突变率显著高于正常组织，而肿瘤和癌旁组织之间差异无显著性。MCC基因10、12、15三个外显子在大肠癌及癌旁组织的突变率与正常组之间差异有显著性，而肿瘤与癌旁之间差异无显著性。APC和MCC二者在癌组织中的总突变率高于APC和MCC单基因的突变率。结论　APC和MCC突变检测有可能用于大肠癌早期基因诊断。

Detection of MCC and APC gene mutations in colorectal carcinoma and the clinical implication

ZHU Liwei, WANG Pengzhi, SU Yanjun, et al.

　　Department of Surgery, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052

　　【Abstract】Objective To study the occurrence mechanism of colorectal carcinoma.Method The changes in mutation cluster region (MCR) of adenomatous polyposic coli (APC) gene and exons 10,12,15 of mutation in colorectal carcinoma (MCC) were separately assayed with polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphisms (PCR-SSCP) technique in 29 samples of colorectal carcinoma, proximal colonic tissue and 24 corresponding samples of tissues surrounding tumor from the patients with colorectal carcinoma.Results The mutation rate of 15G, 15H and 15I fragments in MCR of APC gene were significantly higher in groups of colorectal carcinoma and tissue surrounding the tumor than normal colonic tissues. In contrast, no significant difference was found between colorectal carcinoma and the tissues surrounding the tumor. There was a significant difference in the mutation rate in exons 10, 12, 15 of MCC gene between colorectal carcinoma, the tissues surrounding the tumor and the normal colonic tissues, but no significant difference was found between the colorectal carcinoma and the tissues surrounding the tumor. The total mutation rate of APC and MCC in colorectal carcinoma was 80% and considerably higher than single mutation rate in anyone of these two genes.Conclusion Detection of APC and MCC mutation might be used to early diagnose colorectal carcinoma.

　　【Key words】 Colorectal carcinoma Gene Mutation

　　为探讨大肠癌发病的分子生物学机制，我们采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析技术(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphisms, PCR-SSCP)对29例大肠癌患者的肿瘤、正常组织以及其中24例癌旁组织抑癌基因APC(adenomatous polyposis coli)突变集中区MCR(mutation cluster region)和抑癌基因MCC(mutation in colorectal carcinoma)第10、12、15外显子的变化进行检测，现报道如下。

　　材料和方法

　　1、标本　取自天津医科大学总医院普外科1995年8月～1996年5月手术切除29例大肠癌标本(其中结肠癌20例，直肠癌9例)，24例癌旁3～5 cm组织，29例近切端结肠正常组织。全部标本诊断均经病理检查证实。

　　2、PCR-SSCP检测APC基因突变集中区和MCC基因10、12、15外显子基因突变　本实验设计三对交叠引物(15G、15H、15I)共同扩增APC基因MCR区段。序列如下：15G上游引物5′-AAGAAACAATACAGACTTATTGTG-3′，下游引物5′-ATGAGTGGGGTCTCCTGAAAC-3′； 15H上游引物5′-ATCTCCCTCCAAAAGTGGTG-3′，下游引物 5′-TCCATCTGGAGTACTTTCTGTG-3′；15I：上游引物5′-AGTAAATGCTGCTGCAGTTCAGAGG-3′，下游引物5′-CCGTGGCATATCATCCCCCC-3′。MCC基因突变热点集中的第10、12、15外显子引物如下：MCC-10外显子：上游引物5′-TACGAATCCAATGCCACA-3′，下游引物5′-CTGAAGTAGCTCCAAACA-3′；MCC-12外显子：上游引物5′-ATGTTGATTAATCCGTTGGC-3′，下游引物5′-ACCCCAGAGCAGAAGGCT-3′；MCC-15外显子：上游引物5′-GGCCTAACTGGAATGTGT-3′，下游引物5′-GCCCAGATAAACACCAGC-3′。按文献报道的方法行PCR-SSCP检测所得计数资料采用四格表确切概率法分析，计量资料采用t检验。

　　结果

　　1、APC基因15G、15H、15I突变检测结果　15G、15H及15I在结肠癌、癌旁及正常组织的突变率见表1，结果表明癌、癌旁与正常组织之间的突变率差异有显著性，癌、癌旁的突变明显高于正常，癌与癌旁组织之间差异无显著性。

表1　APC(15G、15H、15I)突变检测

　　注：癌-正常P＜0.01，癌旁-正常P＜0.01，癌-癌旁P＞0.05　　2、MCC基因10、12、15外显子突变检测结果　29例大肠癌标本，相应正常粘膜组织及其中24例癌旁组织MCC-10外显子、MCC-12外显子、MCC-15外显子突变检测结果见表2。统计学处理结果表明，MCC基因突变在癌、癌旁组织与正常之间差异有显著性，癌、癌旁组织的突变率明显高于正常，癌和癌旁组织之间差异无显著性。

表2　MCC-10、12、15外显子突变检测

　　3、APC和/或MCC基因总突变率在大肠癌为79.31%，癌旁组织为66.67%，正常组织为13.79%(表3)。结果表明癌、癌旁组织APC、MCC突变双阳性率明显高于正常，癌、癌旁组织之间差异无显著性。

表3　APC、MCC总突变率检测

　　讨论　　目前研究认为^［1，2］，大肠癌的恶性转化经历如下过程：大肠粘膜上皮细胞经致癌物多次打击而发生异变，这种改变可发生在起显性作用的原癌基因和/或起隐性作用的抑癌基因。APC基因突变发生在转化的早期阶段，它与DCC、MCC同为隐性作用基因。在单个等位基因缺失时，另一相应基因能维持细胞的正常表型。当致癌物2次打击导致这一等位基因也失活时即可能引起细胞表型紊乱，以致发生恶性转化而癌变。结果表明，在肿瘤组织及癌旁组织中MCC和APC基因的突变率与正常组织之间差异有显著性，而肿瘤与癌旁之间差异无显著性。这提示，在大体及病理表现正常的癌旁组织中已存在MCC和APC异常变化，因而推断MCC及APC基因突变应为大肠癌发生的早期事件。

　　作为肿瘤发生学另一重要学说的“肿瘤发生多源性”理论认为，恶性肿瘤具有明显的异质性倾向。肿瘤细胞可来源于不同的干细胞，即使在同一恶性肿瘤实体内也可存在多种异质性癌细胞。癌旁组织可能存在有异质性细胞，也可能存在由正常向恶性转化的早期异常细胞，因此，可作为正常细胞恶性转化过程中的“中间状态”。在恶性肿瘤的浸润性生长过程中，肿瘤细胞向同一类型组织中的“潜行”生长是最重要的浸润方式。大体观察正常的癌旁组织中可能有数量不等的恶性细胞，甚至会有已发生基因突变而形态上尚未完成恶性转化的细胞。本实验结果证实了这一推断。

　　参考文献

　　1　Aaltonem LA, Peltomaki P, Mecklin JP, et al. Replication errors in benign and malignant tumors from gereditary nonpolyposis colorectal cancer patients. Cancer Res, 1994,54:1645-1646.

　　2　Feron ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell, 1990,61:759-760.

(收稿：1998-03-11　修回：1998-09-27)