大肠癌及癌旁组织中端粒酶活性的检测及临床意义^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第10期

张登学　牟永善　顾华丽　唐晓燕　刘海灵

　　摘　要　目的：建立测定端粒酶活性的PCR－TRAP方法并探讨其在大肠癌诊断中的意义。方法：应用端粒酶活性的PCR－TRAP方法，对40例大肠癌及其癌旁组织进行了检测。结果：40例大肠癌组织中有37例端粒酶活性呈阳性，阳性检出率为91.75％，癌旁组织中有2例阳性，阳性检出率为5.00％；两者相比差异有极显著性（P＜0.001）；40例大肠癌均为腺细胞癌，其中11例伴随淋巴结转移的标本中10例检测出活性，而在29例未伴随淋巴结转移的患者中，有27例检测出端粒酶的活性，两者相比，差异无显著性。结论：端粒酶活性增高可能是致大肠组织癌变的重要因素；端粒酶活性的检出可作为大肠癌诊断的指标之一。

　　　关键词：肠肿瘤　端粒酶　活性检测

　　端粒是真核细胞染色体末端特有的重复结构，能够防止染色体发生降解及端－端融合。在细胞分裂时，由于染色体复制的自身缺陷，随着细胞分裂次数的增加其端粒逐渐缩短，最终使细胞进入危机期，导致细胞的死亡^[1]。近期研究表明，在恶性肿瘤及其生化细胞中，端粒酶活性为阳性，因此认为端粒酶与细胞的增殖、分裂和永生化有着密切的关系，在肿瘤的发生发展中起非常重要的作用^[2]。本文采用以PCR技术为基础的端粒酶重复序列扩增（Telomeric repeat amplification protocol,TRAP）方法^[3]对大肠癌及其癌旁组织进行检测，以了解端粒酶在大肠癌发生发展中的作用，并结合临床病理资料分析端粒酶活性检测在大肠癌诊断中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　40例大肠癌及癌旁组织标本均取自我院外科手术，经病理证实为腺细胞癌。其中男23例，女17例；年龄34～72岁。标本离体后1小时内，液氮速冻，－80℃冰箱保存。

　　1.2　试剂

　　EGTA,Hepes,CHAPS,T₄gene32蛋白由Sigma公司生产；32－α－p－dCTP系北京福瑞公司产品；聚丙烯酰氨单体、聚丙烯酰氨双体系美国Sigma公司产品。

　　1.3　蛋白提取

　　每份标本取50～100mg，于液氮瓶内速冻后在研钵内研成粉末，后转移到1.5ml离心管中，立即加入500μl预冷的冲洗液（10mmol/LHepes－KCl,1.5mmol/LMgCl₂,10mmol/LKCl1mmol/LDTT）中充分混匀，冰上静止10分钟，2500rpm/分4℃离心5分钟，弃上清，加入预冷的裂解液200μl(10mmol/LTris－HCl,1mmol/LMgCl₂,1mmol/LEGTA,5mmol/LDTT,0.5％CHAPS,10％甘油)混匀放置冰上裂解20分钟，13000rpm/分4℃离心30分钟，吸取上清转至另一预冷的离心管中。按BCA方法[1]进行蛋白测定，后－80℃冰箱冻存。

　　1.4　引物设计

　　根据文献[2]用下列引物：

　　Ts5′－AATCCGTCGAGCAGAGTT－3′

　　CX 5′－CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA－3′

　　1.5　端粒酶检测

　　采用PCR－TRAP法检测端粒酶活性^[3]，反应混合液中含20UTris－HC1(pH8.3)1mmol/LMgCl₂,63mmol/LKCl,0.005％Tween20,1mmol/LEGTA,50mmol/LdNTP,1μmol/LT₄基因32蛋白，0.1g/LBSA，0.2μCiα－32p－dCTP,2UTaqDNA聚合酶，0.1μgTS引物和6μg蛋白提取物，加高压去离子水至终体积25μl混均后，上层覆盖石蜡油，于37℃保温30分钟。90℃2分钟灭活端粒酶，加0.01μgCX引物在PCR扩增仪上扩增，扩增条件：94℃变性2分钟，95℃40秒，50℃40秒，72℃50秒共31循环；72℃延伸5分钟。取10μ1PCR产物，在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，X线下放射自显影，－80℃24～48小时显示结果，出现6bP梯形带时结果为阳性（附图）。每次检测以6μgHela细胞蛋白做阳性对照，反应混合物中不加蛋白提取物做为阴性对照。

1、阳性对照(HeLa细胞)

　　2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16大肠癌组织

　　10、空白对照阳性为经放射自显影后可见2条以上间隔6bp的梯形带附图大肠癌组织端粒酶的活性

　　1.6　统计学分析

　　采用χ²检验进行统计学分析。

　　2　结果

　　2.1　大肠癌及癌旁组织端粒酶活性检测结果

　　40例大肠癌组织中端粒酶阳性37例，阴性3例，阳性率为91.75％；其相应癌旁组织中端粒酶阳性2例，阴性38例，阳性率为5.00％。大肠癌组织中端粒酶活性的检出率明显高于癌旁组织，两组比较有极显著性差异（P＜0.001）。

　　2.2　端粒酶活性与临床病理之间的关系

　　在检测的40例中其组织学类型均为腺细胞癌，分为高、中、低三种分化状态。其中11例有淋巴结转移。见附表。

附表端粒酶活性与临床病理因素的关系

组别	检测例数	阳性例数
分化程度
高分化	22	21
中分化	15	13
低分化	3	3
淋巴结转移
有	11	10
无	29	27

　　从附表中可以看出，端粒酶的活性与临床分化无明显关系（P＞0.05）。伴有淋巴结转移的大肠癌组织中端粒酶活性的检出率与不伴有淋巴结转移的大肠癌组织中端粒酶活性的检出率相比差异无显著性（P＞0.05）。

　　3　讨论

　　1985年Greider等^[4]从四模虫的细胞提取物中首次发现端粒酶，它是由RNA与核蛋白组成的核糖核体，属于RNA依赖性的逆转录酶，有专一性，能以自身的RNA为模板。从头合成染色体末端重复结构以补偿细胞分裂时端粒酶的缩短，维持端粒酶的长度，保持染色体的动态平衡。目前测定端粒酶的活性主要采用Kim等^[3]建立的高效、灵敏的以PCR为基础的TRAP方法。研究发现，端粒酶和肿瘤细胞之间存在相互激发的关系，它通过合成端粒DNA而稳定端粒的长度，使肿瘤细胞无限制的增殖、分裂^[2,3.5]。过去采用低灵敏度端粒酶的检测方法，认为端粒酶的表达仅限于生殖细胞和永生化细胞，而在正常的体细胞无活性。随着PCR－TRAP方法的应用，人们发现在某些类型的体细胞也有端粒酶的活性，如造血干细胞、淋巴细胞、炎性白细胞和增生的前列腺以及绝经期前后的正常子宫内膜细胞等^[6,7]，但其端粒酶活性的阳性检出率显著低于癌细胞。Shay等^[8]总结归纳了文献报道的人类20余种恶性肿瘤细胞端粒酶的活性资料，发现在895例癌组织标本中，端粒酶的阳性率为85％，而在645例相应的癌旁及正常组织中仅有9％的组织有端粒酶活性，提示端粒酶有可能成为某些肿瘤特异性的标记物及基因治疗的新靶点。我们对40例大肠癌及其癌旁组织进行检测，结果大肠癌组织中端粒酶阳性率为91.75％，癌旁组织的阳性率为5.00％，两组比较差异有极显著性（P＜0.001），从而说明端粒酶在大肠癌的发生发展中可能起到某些重要作用，端粒酶阳性可作为大肠癌的诊断指标之一。

　　肿瘤组织端粒酶的活性与临床病理因素和预后的关系尚无明确的定论^[9]。Hiyama等^[6]认为端粒酶活性与乳腺癌和胃癌肿瘤大小和淋巴结转移有关，可作为一个判定预后的指标。Kyo等^[7]发现妇科肿瘤端粒酶的活性与患者临床病理因素无关。本文结果显示，端粒酶的活性与大肠癌临床分期（高、中、低分化）没有明显关系，同时与是否伴有淋巴结转移相关也不明显，从而说明端粒酶的活性对大肠癌的预后判断作用甚微。我们认为有必要建立端粒酶定量检测方法，进一步研究端粒酶与大肠癌发生发展的关系。

　　＊本文课题受青岛市科学技术委员会基金资助(97－10)

　　作者单位：张登学　牟永善　顾华丽　唐晓燕　青岛医学院附属医院（山东省青岛市266003）

　　刘海灵　中国医学科学院肿瘤研究所

参考文献

　　1 万小云.端粒,端粒酶与恶性肿瘤.国外医学妇产科学分册,1997;24:202

　　2 de Langer T.Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:2882

　　3 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994;266:2011

　　4 Greider CW,Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA of tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature(Lond),1989;337:331

　　5 Counter CM,Hirte HW,Bacchetti S. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:2900

　　6 Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res,1996;55:3259

　　7 Kyo S,Takakura M,Kohama T,et al. Telomerase activity in human endometrium. Cancer Res,1997;610

　　8 Shay JW Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. EJC,1997;33:787

　　9 Engelhardt M,Langenfeld J,Han W,et al. High telomerase activity in primary lung cancers:Association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst,1997;89:1609