完整肽聚糖对实验性大肠癌的抑制作用及其机制探讨

中国微生态学杂志 1999年第5期第11卷 论著

作者：王立生　潘令嘉　陈村龙　郑跃杰　孙　勇　张亚历　周殿元

单位：第一军医大学南方医院全军消化内科研究所　广州　510515

关键词：双歧杆菌；完整肽聚糖；大肠癌；增殖细胞核抗原

　　摘　要　以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，观察了分叉双歧杆菌的完整肽聚糖体内对大肠癌生长的抑制作用，并从细胞增殖活性方面探讨了它的抑瘤机制。结果表明完整肽聚糖注射组大肠癌移植瘤的生长速度、平均瘤重以及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞密度均明显低于肿瘤对照组(P＜0.01)。提示分叉双歧杆菌的完整肽聚糖体内能明显抑制大肠癌的生长，其抑瘤机制之一是降低肿瘤细胞的增殖活性。

THE INHIBITION OF WHOLE PEPTIDOGLYCAN TO EXPERIMENTAL LARGEBOWEL CARCINOMA AND OBSERVATION OF ITS ANTITUMOR MECHANISMS

Wang Lisheng,et al.PLA Institute For Digestive Medicine,

　　The First Military Medical University,Guang Zhou 510515

　　Abstract　The inhibition of whole peptidoglycan of bifidobacteria bifidum to experimental bowel carcinoma was observed in vivo,depending on the animal model of nude mouse transplantation tumors of large bowel carcinoma.Furthermore,its antitumor mechanisms was explored in view of cell proliferating activity.The results showed that the growth rate、average weight of tumors and positive cell density of proliferating cell nuclear antigen was markedly lower when compared with the control group(P＜0.01). It was indicated that whole peptidoglycan of bifidobacteria bifidum could obviously inhibite the growth of large bowel carcinoma in vivo. One of its antitumor mechanisms was to decrease the proliferating rate of tumor cells.

　　Key words　Bifidobacterium Whole peptidoglycan Large bowel carcinoma Proliferating cell nuclear antigen

　　很多微生物及其成份在体内具有抑瘤作用，如BCG、OK-432和短小棒状杆菌等。双歧杆菌是机体肠道内最主要的生理性有益菌，对维持肠道的微生态平衡起重要作用。完整肽聚糖(Whole peptidoglycan,WPG)是双歧杆菌细胞壁中的重要成份。目前已知很多种属的双歧杆菌的WPG在体内能抑制多种肿瘤的发生与发展，如Meth A纤维肉瘤以及Lewis肺癌等^［1］。本文观察了分叉双歧杆菌的WPG体内对大肠癌生物学特性的影响，并从细胞增殖活性方面探讨了它的抑瘤机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物　BALB/c(nu/nu)，雄性，6周龄～8周龄，体重约18g～22g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。

　　1.2　WPG　按Sekine介绍的方法从分叉双歧杆菌细胞壁中提取而成，并经过鉴定^［2］。重庆医科大学检验系胡宏教授惠赠。

　　1.3　大肠癌细胞株　Lovo细胞株为人未分化结肠癌细胞，引自本校病理教研室。按常规传代于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，生长至单层后，以0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，调细胞数为1×10⁷/ml。

　　1.4　大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及WPG的处理措施　动物分为二组：(1)肿瘤对照组：20只裸鼠，实验的第1天于裸鼠的左前肢背部皮下接种Lovo细胞2×10⁶(0.2ml)，第2天起于其腹腔注射PBS液0.2ml，每天一次，连续5天；(2)WPG注射组：20只裸鼠，实验第1天接种Lovo细胞的数量、部位及程序均同肿瘤对照组，第2天起向裸鼠腹腔注射WPG0.25mg(相当于1×10⁹个双歧杆菌)，每天一次，连续5天。出瘤时以游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径，每周测量二次，根据公式计算出肿瘤体积，即体积(v)cm³=(长径×短经²)÷2，同时绘制肿瘤的生长曲线。于实验的第21天处死动物，剥离瘤体，将新鲜肿瘤组织固定于10%中性福尔马林溶液中，常规石蜡包埋，制片，行HE染色，组织学证实为未分化结肠癌。

　　1.5　增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达　采用免疫组化染色，染色程序按免疫组化SP法常规进行。鼠抗人PCNA单抗、生物素化马抗鼠IgG以及SP试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.6　观察指标及统计学处理　PCNA染色阳性切片分别以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中的阳性细胞数，每例计数10个网格，取其均值作为阳性细胞密度，以t检验行统计学处理。

　　2　结　果

　　2.1　WPG的体内抑瘤试验结果　肿瘤对照组及WPG注射组的裸鼠均于接种Lovo细胞后1周左右出瘤，随着时间的延长，WPG注射组裸鼠移植瘤的生长速度显著慢于肿瘤对照组。实验结束时，WPG注射组及肿瘤对照组的平均瘤重分布为1.21±0.07(克)和2.49±0.40(克)，两者比较具有显著性差异(P＜0.01)。具体见图1。

图1　肿瘤对照组及WPG注射组大肠癌移植瘤的生长曲线

　　2.2　大肠癌裸鼠移植瘤组织形态学观察结果　WPG注射组及肿瘤对照组的移植瘤境界清楚，包膜完整，外形不规则。剖开瘤体，WPG注射组瘤体粉红，颜色较苍白，大部分可见散在的出血坏死区，而肿瘤对照组的瘤体鲜红，切面易渗血，仅极少数瘤体见出血坏死区。光镜观察两组均可见瘤细胞呈现弥漫分布，少部分瘤细胞排列成腺管状。和肿瘤对照组相比，WPG注射组的瘤细胞体积较小，密度较稀，间质较多，核分裂像较少，并可见较多量的核崩解、核碎裂及均匀红染无结构的坏死区。

　　2.3　大肠癌裸鼠移植瘤组织PCNA免疫组化染色结果　所有移植瘤组织免疫组化染色均呈阳性反应，阳性细胞核呈棕黄色，背景清晰，呈弥散分布。肿瘤对照组及WPG注射组大肠癌移植瘤的PCNA阳性细胞密度分别为159.60±14.26和96.30±12.35，两者比较具有显著性差异(P＜0.01)。具体见图2，3。

图2

图3

　　3　讨　论

　　双歧杆菌在体内具有生物学屏障、抗感染、控制内毒素血症、免疫赋活、延缓衰老以及抗肿瘤等多种重要生理功能^［3，4］。WPG是双歧杆菌细胞壁中的一种多糖复合物，它保持了全菌的一些重要生物学特性。Sekine等将婴儿型双歧杆菌细胞壁中的WPG和Meth A纤维肉瘤细胞混合接种到小鼠皮下，结果证实它能显著抑制该瘤的生长，此外将WPG注射于荷瘤鼠的Meth A纤维肉瘤的瘤体内，也具有较明显的抗肿瘤作用。作者认为WPG是双歧杆菌发挥抗肿瘤作用的最主要成份，也是一种无任何毒副作用的生物反应调节剂^［1］。Ishihara等将婴儿型双歧杆菌的WPG注射于恶性黑色素瘤患者的皮肤转移灶内，结果证实WPG能使转移灶体积明显缩小，效果和IFN-γ相当^［5］。本文结果中，WPG注射组大肠癌移植瘤的生长速度以及实验结束时移植瘤的平均重量均明显低于肿瘤对照组，并且WPG注射组移植瘤普遍存在坏死现象，提示分叉双歧杆菌的WPG体内对大肠癌的生长具有明显的抑制作用。

　　PCNA主要表达于细胞增殖周期的S期，是控制DNA复制以及细胞分裂的关键因素，因此它的表达程度反映了细胞增殖活性的高低^［6］。本文结果中，WPG注射组大肠癌裸鼠移植瘤的PCNA阳性细胞密度显著低于肿瘤对照组，这说明分叉双歧杆菌的WPG能明显降低大肠癌移植瘤的增殖活性，使之处于S期的细胞比例显著降低，因而肿瘤的生长速度明显减慢。

　　目前WPG的抑瘤机制尚未完全阐明。多数研究表明它主要是通过激活机体的免疫系统来实现其抗瘤目的。它能激活巨噬细胞，使之吞噬功能增强，并分泌多种具有杀瘤功能的效应分子，同时也能诱导B淋巴细胞分泌多种抗体以及增强CTL和NK细胞的杀伤功能^［7，8］。本文对大肠癌移植瘤进行了病理组织学检查以及PCNA的免疫组化染色，发现WPG注射组移植瘤的增殖活性、瘤细胞密度、核分裂像均显著低于肿瘤对照组，因此我们认为WPG的另一抑瘤途径是降低肿瘤细胞的增殖活性。

　　参考文献

　　1　Sekine K,Ohta J,Ohnishi M,et al.Significance of bacterial structure of WPG related to antitumoral activity. Biotherapy.1990;6:329-335

　　2　乐军，胡宏.双歧杆菌细胞壁完整肽聚糖的分离与纯化.中国微生态学杂志.1997；9：10-13

　　3　王立生，潘令嘉，郑跃杰，等.双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1及IL-6的影响.中国微生态学杂志.1998；10：129-131

　　4　王立生，潘令嘉，郑跃杰，等.双歧杆菌诱导实验性大肠癌凋亡的电镜观察.中国微生态学杂志.1998；10：193-195

　　5　Ishinara K,hayasaka k,Yamazaki N,et al.Current status of melanoma treatment with interferon,cytokines and other biological response modifiers in Japan,J invest Dermatol.1989;92:(5 Suppl) 326S-328S

　　6　Connolly KM and Bogdanffy MS.Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as an endogenous marker of cell proliferation in rat liver:a dual staining comparision with 5-bromo-2-deoxyuridine,J Histochem Cytochem.1993;41:1-15

　　7　Sekine K,Watanabe-Sekine E,Toida T,et al.Adjuvant activity of the cell wall of bifidobacterium infantis for in vivo immune responses in mice.Immunopharm acol lmmunotoxical.1994:16:589-609

　　8　Sasaki T,Fukami S and Namioka S.Enhancement of cytotoxic activity of lymphocytes in mice by oral administration of peptidoglycan (PG) derived bifidobacteri um thermophilum,J Vet Med Sci.1994;56:1129-1133

(收稿日期：1999-01-18)