8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞生长相关基因表达的影响
解剖学报 1999年第3期第30卷 论著
作者：陈奎生郑乃刚吴景兰 丁一 王一菱
单位：陈奎生(现在河南医科大学病理解剖教研室暨河南省肿瘤病理重点实验室工作，郑州 450052)；吴景兰 丁一 王一菱(河南医科大学分子细胞生物学研究中心）；郑乃刚（河南临床检验中心，郑州 450052)
关键词：8-Br-cAMP；；基因表达；Eca-109细胞系
【摘要】 目的 探讨8-Br-cAMP对人Eca-109细胞与生长相关基因表达的影响。 方法 体外培育的人食管癌Eca-109细胞受8-Br-cAMP处理后，用原位杂交、免疫组织化学及RNA、蛋白质斑点印迹技术研究了与细胞生长相关的几种基因的表达变化。 结果 8-Br-cAMP可减弱EGFR、H-ras、c-myc、突变型p53等基因的表达，增强野生型p53基因表达和p21WAF1蛋白的表达。 结论 8-Br-cAMP可通过影响有关信号传递和细胞周期进程基因表达而抑制细胞生长。
EFFECTS OF 8-Br-cAMP ON GROWTH RELATED GENE EXPRE-
SSION OF HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELL LINE Eca-109
Chen Kuisheng,Zheng Naigang*,Wu Jinglan△,Ding Yi,Wang Yiling
(Molecular Cell Biology Research Center,Henan Medical University,Zhengzhou;
*Henan Clinical Experimental Center,Zhengzhou)
【Abstract】 Objective To study the effects of 8-Br-cAMP on growth related gene expression of human esophageal cancer cell line Eca-109.Methods After the human esophageal Eca-109 cells were cultured in the media containing 10-5mol/L of 8-Br-cAMP,the alteration of gene expression related to growth was studied by in situ hybridization,immunohistochemistry and RNA dot blot and protein dot blot techniques.Results The 8-Br-cAMP effects showed down-regulation of gene expression of EGFR,H-ras,c-myc and mp53(mutant type p53);and up-regulation of gene expression of wp53(wild type p53)and phenotype of p21WAF1.Conclusion 8-Br-cAMP could inhibit the growth of Eca-109 cells by affecting the gene expression related to the signal transduction and cell cycle progressing.
【Key words】 8-Br-cAMP;Gene expression;Eca-109 cell line
已知8-氯-cAMP(8-Cl-cAMP)、8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)为蛋白激酶A(PKA)RⅡ亚基位点选择性结合的cAMP类似物。对乳腺癌、直肠癌、肺癌、白血病、胃癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤及脑膜瘤等多种癌细胞具有抑制生长和促进分化的效应［1，2］，但8-Cl-cAMP等对人食管癌细胞的效应尚未见报道。国外虽已将作用较强的8-Cl-cAMP应用于恶性肿瘤的Ⅰ期临床研究［3］，但对此种类似物作用机制的探讨多采用更经济的8-Br-cAMP进行研究。本研究是将8-Br-cAMP加入体外培养的人Eca-109细胞，观察其对细胞生长有关的EGF受体(EGFR)、H-ras、c-myc、野生型p53(wp53)和突变型p53(mp53)等的mRNA及p21WAF1蛋白表达的影响。
材料和方法
1.标本制备
将人食管癌Eca-109细胞系(河南省肿瘤研究所提供)培养于RPMI-1640(Gibco)加10%胎牛血清的培养液中，分为两组：实验组(EG)加8-Br-cAMP(Sigma公司)，终浓度为10-5mol/L。对照组(CG)不加8-Br-cAMP。培养24h后，用胰蛋白酶(Sigma公司)消化两组细胞后；1 500 r/min离心10min；弃上清，各加1ml培养液，反复轻轻吹打成细胞悬液。调细胞悬液浓度为3.1×106/ml,按每片、每点20μl将各细胞悬液滴加于载玻片及硝酸纤维素膜(NCM)上。重复实验2次。
2.Giemsa染色
按1∶9比例将Giemsa染液和磷酸缓冲液混合成染色液。细胞标本用甲醇固定10min后滴加染色液染色15min,晾干后计算细胞分裂指数(每组各计细胞1 000个)。重复实验2次。
3.原位杂交
应用原位杂交技术及完整细胞原位RNA斑点印迹技术［4］，分别以生物素标记的cDNA探针［(EGFR1.8kb,c-myc1.4kb北京中山公司；H-ras1.0kb,wp53 1.8kb,mp53 1.8kb,北京华美公司)；(经检测探针灵敏度均达1μg/L)］检测EGFR、c-myc、H-ras、wp53、mp53等的mRNA,信号显色采用碱性磷酸酶体系［链霉亲合素(SA)，生物素碱性磷酸酶(Bio-AP)，底物为5-溴4-氯3-吲哚磷酸(BCIP)及硝基蓝四唑盐(NBT)］。以100mg/L RNase37℃预消化60min或不加探针杂交试验作为阴性对照。
4.免疫组织化学
应用p21WAF1单抗(DAKO)以免疫组织化学复合蛋白质斑点印迹技术［5］检测Eca-109细胞的p21WAF1蛋白表达，以正常鼠血清代替p21WAF1单抗作阴性对照。重复实验2次。
5.结果分析
依据原位杂交及免疫组织化学信号强度，在油镜下计数分级数值(分级标准见表1)，以岛津薄层扫描仪测定硝酸纤维素膜的斑点印迹信号强度，然后进行统计学处理。
表1 原位杂交及免疫组织化学信号阳性结果的分级和评分标准
Table 1 The standards of classification and scores for positive signals of both in situ hybridization
and immunohistochemistry
| 等级
classification |
等级标准
standards of classification |
评分
scores |
| ± |
细胞阳性颗粒信号很弱
(the cell fine granules with more weak positivity) |
1 |
| + |
细胞阳性颗粒信号较强
(the cell fine granules with weak positivity) |
2 |
| + + |
细胞阳性颗粒信号强
(the cell fine granules with intense positivity) |
3 |
| + + + |
细胞阳性颗粒信号很强
(the cell fine granules with more intense positivity) |
4 |
结 果1.有丝分裂指数(表2)
实验组有丝分裂指数低于对照组。
表2 实验组和对照组有丝分裂指数(
±s)
Table 2 Mitotic index of EG and CG(±s)
| 细胞数
the number
of cells |
对照组(‰)
control group
(CG)‰ |
实验组(‰)
experimental group
(EG)‰ |
| 1 000 |
41.00±3.82 |
24.00±1.97 |
CG：EG， P＜0.01
2.玻片细胞标本原位杂交
各种基因表达的mRNA信号呈蓝紫色颗粒，定位于胞质内。两组的分级数值见表3。实验组与对照组相比，EGFR、c-myc、H-ras、mp53的mRNA信号减弱，而wp53 mRNA信号增强(图1～10)。
表3 实验组(EG)与对照组(CG)原位杂交信号分级数值(±s)比较
Table 3 Graded integral value of in situ hybridization signals in EG compared with control(±s)
| mRNA |
EGF受体(EGFR) |
c-myc |
H-ras |
野生型p53(wp53) |
突变型p53(mp53) |
| 实验组(EG) |
1.98±0.25 |
1.95±0.14 |
1.97±0.13 |
2.85±0.21 |
1.95±0.14 |
| 对照组(CG) |
2.70±0.37 |
2.75±0.08 |
2.86±0.19 |
2.00±0.21 |
2.83±0.25 |
| P值 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
＜0.01 |
3.NCM细胞标本斑点印迹信号测定
各种基因RNA斑点印迹信号扫描数值见表4
表4 实验组(EG)与对照组(CG)RNA斑点印迹信号扫描数值(±s)比较
Table 4 Scanning value of RNA dot blot signals in EG compared with control(±s)
| mRNA |
EGF受体(EGFR) |
c-myc |
H-ras |
野生型p53(wp53) |
突变型p53(mp53) |
| 实验组(EG) |
478.50±221.64 |
618.67±335.15 |
559.00±267.72 |
1 444.83±353.70 |
853.33±73.31 |
| 对照组(CG) |
1 404.00±342.25 |
2 274.25±1 359.95 |
2 363.25±324.00 |
365.0±52.13 |
1 318.25±353.70 |
| P值 |
＜0.002 |
＜0.005 |
＜0.001 |
＜0.001 |
＜0.02 |
4.p21WAF1-IR蛋白表达测定
p21WAF1-IR实验组强于对照组(图11，12)，其蛋白质斑点扫描数值见表5。
表5 WAF1蛋白斑点印迹扫描数值(±s)
Table 5 Scanning value of WAF1 protein dot blot(±s)
| 对照组
control group(CG) |
实验组
experimental group(EG) |
| 2.37±0.23 |
2.78±0.24 |
CG：EG，P＜0.01
讨 论
本实验结果见到8-Br-cAMP明显降低Eca-109细胞生长率，抑制该细胞系生长增殖。已知c-myc基因可促使细胞从G1期进入DNA合成期，进而促进细胞增生。近年研究表明，wp53基因抑制细胞增生是间接的，wp53基因编码的p53蛋白是反式转录因子，可增强WAF1基因表达p21WAF1蛋白［6］。此21kD的蛋白对cdk2酶活性有抑制作用，阻碍细胞进入DNA合成期，使细胞不能进行分裂。此外，Ally［7］应用8-Br-cAMP抑制肺癌细胞生长的研究中，观察到c-myc基因表达降低；Bennett［8］应用8-Br-cAMP抑制平滑肌细胞生长也观察到同时伴有c-myc基因表达减弱。本实验见到以8-Br-cAMP处理后的Eca-109细胞，可增强wp53基因表达和WAF1蛋白表达，而减弱mp53基因表达，提示8-Br-cAMP可通过减弱c-myc、mp53表达和增强wp53、p21WAF1的表达而抑制细胞周期的进展，阻抑细胞生长。
已知在跨膜信息传导途径中，当受体与配体结合后多通过G蛋白的转导而改变腺苷环化酶活性，进而调节cAMP的生成并可影响DG-PKC途径［9］。H-ras癌基因表达异常的p21RAS蛋白使G蛋白的转导作用及腺苷环化酶活性缺陷，cAMP生成减少，刺激细胞生长。食管癌的EGFR基因多是去头的［10］，仅编码受体跨膜及胞质的EGFR蛋白，其酪氨酸激酶活性不需要EGF配体与受体结合即可持久地自我磷酸化，而传递生长信号刺激细胞生长。本实验以8-Br-cAMP培育Eca-109细胞，原位杂交和RNA斑点印迹试验中H-ras和EGFR基因表达均明显减弱，Iwamoto应用8-Br-cAMP处理转化的NIH-3T3细胞，也发现H-ras基因表达降低［11］，与本实验结果相似。提示8-Br-cAMP可通过减弱有关信号传递的基因表达而抑制细胞生长。
图版说明
图1 实验组EGFR mRNA位于胞质，信号极弱 ×1 000
2 对照组EGFR mRNA位于胞质，信号较强 ×1 000
3 实验组H-ras mRNA位于胞质，信号较弱 ×1 000
4 对照组H-ras mRNA位于胞质，信号较强 ×1 000
5 实验组c-myc mRNA位于胞质，信号较弱 ×1 000
6 对照组c-myc mRNA位于胞质，信号较强 ×1 000
7 实验组野生型p53 mRNA位于胞质，信号较强 ×1 000
8 对照组野生型p53 mRNA位于胞质，信号较弱 ×1 000
9 实验组突变型p53 mRNA位于胞质，信号较弱 ×1 000
10 对照组突变型p53 mRNA位于胞质，信号较强 ×1 000
11 实验组p21WAF1定位于胞核和胞质，信号较强 ×1 000
12 对照组p21WAF1定位于胞核和胞质，信号较弱 ×1 000
△ Molecular Cell Biology Research Center,Henan Medical Univeristy,Zhengzhou 450052,China
参考文献
［1］Cho-chung YS.Site-selective 8-chloro-cyclic adenosine 3′,5′,monophosphate as a biologic modulator of cancer:restoration of normal control mechanims.J Natl Cancer Inst,1989,81(13):982
［2］Katsaros D,Tortora G,Tagliaferri P,et al.Site-selective cyclic AMP analogs provide a new approach in the control of cancer cell growth.FEBS Lett,1987,223(1):97
［3］方家椿，石永进，彭敬，等.8-Cl-cAMP及其衍生物对HL-60细胞生长抑制和分化诱导作用的初步研究.中华肿瘤杂志，1993，15(2)：141
［4］Larsson LI.Optiomization of non-radioactive in situ-hybridization:image analysis of varying pretreatment,hybridization and probe labelling conditions.Histochemistry,1990,93(4):347
［5］郑乃刚，吴景兰，陈奎生，等.免疫组织化学与完整细胞原位蛋白质斑点印迹联合应用的探讨.河南医科大学学报，1997，32(3)：118
［6］Wafik S,Takashi T,Victor E,et al.WAF1,a potential mediator of p53 tumor suppression.Cell,1993,75(19):817
［7］Ally S,Clair T,Katsaros D,et al.Inhibition of growth and modulation of gene expression in human lung carcinoma in athymic mice by site-selective 8-Cl-cyclic adenosine monophosphate.Cancer Res,1989,49(15):5650
［8］Bennett MR,Littlewood TD,Hancock DC,et al.Down-regulation of the c-myc proto-oncogene in inhibition of vascular smooth-muscle cell proliferation:a signal for growth arrest? J Biochem,1994,302(pt3):701
［9］黄治森.生物化学.北京：人民卫生出版社，1980：242
［10］吴平.表皮生长因子受体.生理学进展，1990，2(1)：11
［11］Iwamoto Y,Reich R,Nemeth G,et al.Cyclic AMP decreases chemotaxis invasiveness and lung colonization of H-ras transformed mouse fibroblasts.Clin Exp Metastasis,1993,11(6):492
收稿1998-01 修回1998-10
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