CYP1A1、GSTM1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系

　　中华流行病学杂志2000年第21卷第6期

邵根泽　苏艳蓉　黄革　温博贵

　　摘　要　目的　探讨CYP1A1、GSTM1基因多态性与食管癌遗传易感性的可能关系。方法　采用PCR法对正常人和食管癌患者基因组DNA进行CYP1A1、GSTM1基因分型。结果　食管癌组GSTM1(-/-)型频率(64%)高于正常对照组(50%)(P＜0.05); 食管癌CYP1A1基因I/I、I/V、V/V基因型频率与正常组相比差异无显著性，尽管食管癌CYP1A1基因I/V、V/V型频率(60%)稍高于正常对照组(50%)(P=0.16)。当研究对象按CYP1A1（I/I）和GSTM1基因分类时，发现：①在GSTM1（+）人群中，食管癌组CYP1A1(I/V、V/V)基因型频率(64%)高于正常组(41%)(P＜0.05)。②在CYP1A1（I/I）型人群中，食管癌组GSTM1(-/-)型频率(67%)显著高于正常对照组(40%)(P＜0.01)。结论　GSTM1、 CYP1A1基因多态性与食管癌易感性相关，GSTM1(-/-)型个体食管癌易感性增高; gSTM1（+）/CYP1A1(I/V、V/V)型和GSTM1(-/-)/CYP1A1（I/I）型个体比GSTM1（+）/CYP1A1（I/I）基因型个体具有更高的食管癌的易感性。

　　关键词：食管肿瘤；细胞色素P450酶；谷胱甘肽硫转移酶；多态现象

　　细胞色素P450酶（CYP450）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）分别是细胞内重要的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，在致癌物的活化和解毒过程中起重要作用。人类GST基因家族分为α、μ、π、θ四型^［1］，GSTM1基因是其中的一个亚型，定位于染色体1p13，有GSTM1a、GSTM1b、GSTM1(-)三个等位基因，其中GSTM1(-)是空白等位基因。GSTM1负责对苯并芘代谢的活性产物－环氧或羟化物的解毒，GSTM1(-/-)基因型个体缺乏GST酶活性，失去了解毒功能，增加个体患癌的危险性^［2］。CYP1A1定位于染色体15q²²-q¹⁴,编码芳烃羟化酶(AHH)^［3］。该基因第7外显子的点突变导致第462号密码子Ile→Val的改变，引起三种多态性：CYP1A1(I/I)、CYP1A1(I/V)、CYP1A1(V/V)。研究表明，其多态性与多种肿瘤易感性相关。在肺癌，CYP1A1(V/V)基因型个体肿瘤易感性增高^［4］。

　　食管癌是严重危害人类健康的疾病，流行病学调查表明，它不但与环境因素，而且与遗传背景相关。潮汕地区是南方沿海食管癌高发区，对该地区人群进行CYP1A1、GSTM1基因的分子流行病学调查研究，将有利于揭示食管癌发生的病因，提高对肿瘤易感者预测的水平。

　　材料与方法

　　一、标本

　　经临床病理检查确诊为食管鳞状细胞癌患者107例，其中男74例，女33例，年龄30～70岁,平均年龄(55±5.4)岁。标本取自汕头大学医学院附属肿瘤医院，为新鲜手术癌组织标本。正常对照血液标本111例取自汕头市职业病防治所，其中男80例，女31例，平均年龄(53±4.8)岁，为正常体检标本。所有标本均取自潮汕籍人群，部分患者有吸烟史。病例组和对照组在年龄、性别、民族构成上均衡可比。

　　二、DNA提取

　　取患者癌组织匀浆或提取正常人外周血白细胞，加入适量DNA抽提液和蛋白酶K（80μg/ml），55°C消化3 h。酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀、70%乙醇洗涤晾干后，溶于适量10 mmol/L Tris-Cl,1 mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液中。

　　三、基因分型

　　1.GSTM1基因分型^［5］：合成以下引物P₁：5′-CGCCATCTTGTGCTACATTGCCCG-3′， p₂：5′-ATCTTCTCCTCTTCTGTCTC-3′， P₃:5′-TTCTG

　　gATTGTAGCAGATCA-3′。PCR扩增：反应总体积50 μl，其中200 μmol/L dNTPs; 10×PCR Buffer 5 μl; 1.5mmol/L MgCl₂; 基因组DNA 0.2 μg;引物P₁ 600　ng , P₂ 300　ng, P₃ 300　ng;矿物油30 μl。96℃ 预变性6 min；加入Taq DNA 聚合酶1.5 U后，置于GTC-2热循环仪上反应：94℃40 s，52℃ 60 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 6 min。琼脂糖凝胶电泳检测。

　　2. CYP1A1基因分型^［6］：引物P₄：5′-GAACT

　　gCCACTTCAGCTGTCT-3′, P_5a: 5′-AAGACCTC

　　cCAGCGGGCAAT-3′, P_5b: 5′-AAGACCTCCCAG

　　cGGGCAAC-3′。 96℃预变性6 min；加入Taq DNA 聚合酶1.5 U后，置于GTC-2热循环仪上反应：95℃50 s，70℃ 60 s， 30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测。

　　四、统计学分析

　　以χ²检验分析GSTM1、CYP1A1基因多态性与食管癌遗传易感性的关系，以比值比（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对危险度。用Hardy-Weinberg遗传平衡定律拟合、χ²检验分析对照组CYP1A1各基因型频率，评估其代表性。

　　结　　果

　　一、基因分型

　　P₁、P₃是GSTM1基因型特异性引物，扩增GSTM1基因外显子4与外显子5间一230 bp DNA片段；P₁、P₂扩增产物为一157 bp DNA片段，作为实验内对照。凡GSTM1基因阳性［GSTM1(+/+)和GSTM1(+/-)］标本均可同时扩增出157 bp、230 bp两DNA片段；而GSTM1（-/-）基因型标本只扩增157 bp DNA片段，无230 bp特异DNA片段（图1）。CYP1A1有Ile纯合子（I/I）、杂合子（I/V）以及Val纯合子（V/V）三种基因型：只扩增引物P₄、P_5a的标本，其基因型为I/I；只扩增引物P₄、P_5b的标本，其基因型为V/V；二对引物均扩增者为I/V型（图2）。

图1　GSTM1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(2%)图谱

　　二、正常对照人群各基因频率及基因型频率

　　CYP1A1 Ile基因频率为0.725，Val基因频率为0.275。CYP1A1 I/I、 i/V 、V/V基因型频率分别为0.50、0.46、0.04，预期基因型频率为0.526、0.399、0.076，经χ²检验差异无显著性（χ²=2.584, p＞0.1），符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，因此该人群具有代表性。GSTM1（-/-）基因型频率为0.495，GSTM1（+）基因型［GSTM1(+/+)和GSTM1(+/-)］频率为0.505。

图2　CYP1A1基因分型

　　三、食管癌患者GSTM1 、CYP1A1基因型频率

　　食管癌和正常人GSTM1 、CYP1A1基因分型结果见表1。在107例食管癌患者中，39例（36%）GSTM1基因阳性，68例（64%）为GSTM1(-/-)基因型；而对照组111例正常人标本中检测到56例（50%）GSTM1基因阳性，55例（50%）为GSTM1(-/-)基因型。经统计学分析，两组GSTM1(-/-)基因型频率差异存在显著性(P=0.0384＜0.05，OR=1.76，95%CI：1.027～2.737)。食管癌CYP1A1 I/I、I/V和V/V基因型频率分别为40%、52%和8%；与正常对照组相比（50%、46%、4%）差异无显著性（P＞0.05）。但食管癌CYP1A1含至少一个Val等位基因(I/V+V/V)的频率(60%)比正常对照高(50%)（P=0.16）。

　　四、CYP1A1(I/I)基因型人群GSTM1(-/-)基因型频率比较

　　43例CYP1A1(I/I) 基因型食管癌患者中，29例（67%）为GSTM1(-/-)基因型；而55例CYP1A1(I/I)基因型正常人中只有22例（40%）为GSTM1(-/-)基因型，两组GSTM1(-/-)基因型频率差异存在显著性（表2）。

　　五、GSTM1（+）基因型人群CYP1A1(I/V+V/V)型频率比较

　　39例GSTM1（+）型食管癌患者中，64%为CYP1A1(I/V+V/V)型；56例正常对照中41%为CYP1A1(I/V+V/V)型，两组CYP1A1(I/V+V/V)型频率差异存在显著性（表3）。

　　讨　　论

　　研究表明，约90%的肿瘤发生可能与环境致癌因素有关，人群对各种致癌因子的反应存在明显的差异。这种个体肿瘤易感性差异主要是由于肿瘤易感基因（包括代谢酶基因）的遗传多态性所决定^［7］。

　　本文研究了GSTM1 、CYP1A1基因多态性与食管癌易感性的关系。结果表明，GSTM1(-/-)基因型在食管癌组频率显著升高（P＜0.05，OR=1.76）；当研究对象的基因型为CYP1A1（I/I）时，这种差异更加显著（P＜0.01,OR=3.11）。以上提示GSTM1(-/-)基因型个体食管癌易患性增高。GSTM1基因产物可能参与致癌物的解毒，GSTM1(-/-)基因型个体缺乏GSTM1酶活性，不能代谢这些致癌物，从而导致肿瘤易感性增高。目前研究已经证实，GSTM1基因多态性与肺癌、结肠癌、膀胱癌、皮肤癌等肿瘤的易感性相关，GSTM1(-/-)基因型个体患癌的危险性明显增加，尤其是那些重度吸烟患者^［5,7,8］。

　　本文对CYP1A1的研究表明，食管癌组CYP1A1各基因型（I/I、I/V、V/V)频率分布与对照组相比差异无显著性，尽管CYP1A1“异常”基因型（I/V、V/V）频率在食管癌组有升高的趋势（50%→60%，P=0.16），这与Nimura^［9］对日本食管癌的研究结果较为一致。但当研究对象按GSTM1基因分类时，发现在所有GSTM1(+)型个体中，食管癌组CYP1A1（I/V、V/V）基因型频率显著高于正常对照组（P＜0.05, oR=2.56），提示同为GSTM1(+)时，CYP1A1(I/V、V/V)型个体患食管癌的风险比CYP1A1(I/I)型个体高，表明CYP1A1基因的多态性与个体肿瘤易感性有一定关系。 cYP1A1是细胞内重要的Ⅰ相代谢酶,编码芳烃羟化酶(AHH),催化底物的氧化,可能引起一些原致癌物的活化。此基因第7外显子的点突变导致第462号密码子Ile→Val的改变，引起酶活性的改变。目前研究已证实, cYP1A1(V/V)基因产物比CYP1A1（I/I）型产物具有更高的催化和“致癌”活性，使原致癌物活化，增加个体患癌风险^［6］。

表1　CYP1A1 和 GSTM1基因分型结果

　　* P＜0.05, OR=1.76, 95%CI:1.027～2.737；括号内数字为构成比

表2　CYP1A1(I/I) 基因型人群GSTM1(-/-)基因型频率比较

　　注：括号内数字为百分比

表3　GSTM1（+）基因型人群CYP1A1(I/V+V/V)型频率比较

　　注：括号内数字为百分比　　肿瘤的易感性取决于原致癌物能否被活化，活化的致癌物在多大程度上被灭活以及两者相互作用的净结果。CYP1A1和GSTM1基因的多态性是影响肿瘤易感性的重要因素，因此同时检测鉴定其型别对预测、比较个体的肿瘤易感性具有重要意义。本文研究发现，CYP1A1（I/I）/ gSTM1(-/-)型个体以及CYP1A1(I/V,V/V)/GSTM1(+/+)型个体食管癌易患风险比CYP1A1(I/I)/GSTM1(+/+)型个体分别高3.11和2.56倍，提示肿瘤易感性与CYP1A1、GSTM1的相关性。

　　与本文研究不同的是,对河南、日本食管癌的研究表明，食管癌易感性似乎与GSTM1基因多态性无关^［10,11］。这种不同甚至矛盾的研究结果不只见于食管癌，在其他肿瘤中也同样存在（如肺癌）^［7］。目前尚不清楚这种差异的原因所在，但反映出肿瘤易感性的复杂性。它除涉及解毒过程中其他代谢酶基因及其相互作用，还与环境致癌因素有关。潮汕地区是南方沿海食管癌高发区，从地理环境到居民的生活习惯都有别于河南林县等其他食管癌高发区，较高的GSTM1(-/-)型频率可能提示本地区存在GSTM1(-/-)型个体敏感的某种致癌因子，致癌因子暴露下的GSTM1(-/-)基因型个体肿瘤易感性增高。吸烟被证实是多种肿瘤重要的危险因素之一，但与食管癌的相关性尚不清楚，有报道GSTM1基因缺陷与重度吸烟者食管癌易感性相关。但本文的研究并未证实吸烟、喜饮浓茶（功夫茶）等习惯与食管癌GSTM1、CYP1A1基因多态性及食管癌遗传易感性的关系。

　　基金项目：广东省卫生厅青年科学基金资助项目(B1997077)

　　作者单位：邵根泽（汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室　515031)

　　苏艳蓉（汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室　515031)

　　黄革（汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室　515031)

　　温博贵（汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室　515031）

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