肿瘤新生血管形成在胃癌预后中的价值

中华外科杂志 1998年第5期第36卷 临床研究

作者：陶厚权　林言箴　尹浩然　王瑞年

单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院外科(陶厚权、林言箴、尹浩然)；上海第二医科大学病理教研室(王瑞年)

关键词：胃肿瘤；新生血管化；预后

　　【摘要】　目的　探讨肿瘤新生血管形成在胃癌进展中的作用。方法　利用抗人因子Ⅷ相关抗原（F-ⅧRAg）抗体的免疫组织化学LSAB法，对131例胃癌患者手术切除标本中微血管进行定量。计数200×视野下5个最高血管密度区的微血管数(MVC)，取其均数，分析MVC与不同临床病理因素及预后之间的关系。结果　MVC随TNM分期而增加（P＜0.01）。 MVC与癌组织浸润的深度（P＜0.05）、淋巴结转移（P＜0.01）和远处转移（P＜0.05）有关。高MVC组（MVC≥16）根治术的复发率（58.4%）明显高于低MVC组（MVC＜16）的复发率(29.7%)（P＜0.05），高MVC患者预后较低MVC者差（P＜0.05）,5年生存率可通过P=e^{1.6231－0.1036*MVC}1+e^{1.6231－0.1036*MVC}进行估算。多因素分析表明，MVC是胃癌的一个独立预后因子。　结论　胃癌组织内的MVC 是预测肿瘤恶性行为的一个有用指标，可用于识别有高危复发和不良预后的病例。

　　Prognostic value of tumor vascularity in gastric carcinoma Tao Houquan, Lin Yanzhen, Yin Haoran, et al. Department of Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025.

　　【Abstract】　Objective　To determine whether tumor angiogenesis correlates with progression of gastric carcinoma.　Method　Microvessel counts (MVC) of 131 specimens resected from patients with gastric carcinoma were investigated by immunohistological staining with a monoclonal antibody against F-Ⅷ RAg, counting the mean number of microvessels in the five areas of highest vascular density under 200 times magnification microscopy. Correlation among MVC, various clinicopathologic factors, and prognosis was studied.　Result　MVC increased with TNM stage, the MVC of patients with advanced stage disease was significantly higher than that of early stage patients (P＜0.01). MVC was significantly higher in tumors with deep penetration (P＜0.05), lymph node metastasis (P＜0.001) and distant metastasis (P＜0.05) than in those without invasion and such metastasis. The recurrence rate after curative resection in hypervascular group(MVC≥16) was 58.4%, which was significantly higher (P＜0.05) than that in the hypovascular group(MVC＜16). Moreover, the prognosis of patients with a high MVC was significantly poorer than that of those with a low MVC. The probability of 5 year survival rate was estimated by P=e^{1.6231－0.1036*MVC}1+e^{1.6231－0.1036*MVC}. Multivariate analysis indicated that MVC is an independent prognostic factor in gastric cancer.　Conclusion　Angiogenesis within gastric cancer is an indicator of tumor behavior and may identify patients at higher risk for recurrence and poorer prognosis.

　　【Key words】　Stomach neoplasms　　Neovascularization　　prognosis

　　为进一步了解胃癌新生血管形成在癌组织浸润转移中的作用，探讨胃癌中微血管数量（MVC）作为胃癌预后指标的可行性，我们利用抗人因子Ⅷ相关抗原（F-ⅧRAg）抗体显示微血管的免疫组织化学技术，观察了胃癌组织中MVC与临床病理因素及预后之间关系。

资料和方法

　　1．临床资料: 131例胃癌标本取自瑞金医院外科1988～1991年间行手术切除肿瘤的胃癌患者。患者年龄32～80岁（平均58.8±11.2）。男性88例，女性43例。所有患者术前均未接受化疗或放疗。病理诊断和分级按全国胃癌协作规范进行。本研究中，将胃癌再归纳成两大类型：分化型包括乳头状腺癌和管状腺癌；未分化型包括分化不良型腺癌、印戒细胞癌和粘液腺癌。112例患者行胃癌根治术，19例行故息性切除术。所有患者术后均进行了5年以上随访。胃癌标本以10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，切片厚度4 μm。

　　2．主要试剂: 抗F-Ⅷ RAg抗体及LSAB Kit均为Dako公司产品。

　　3．微血管染色、定量方法:(1) 微血管染色：采用免疫组织化学LSAB法。切片经常规脱蜡及水化；0.3%H₂O₂甲醇灭活内源性过氧化物酶，室温孵育30分钟，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3次；37℃环境中0.05%胰蛋白酶消化20分钟；滴加1∶20稀释的正常羊血清,30分钟后倾去；滴加抗F-ⅧRAg抗体(1∶100稀释)，室温孵育2小时，PBS洗3次；加兔抗鼠生物素化二抗(1∶400稀释)，室温孵育1小时，PBS洗3次；滴加1∶400稀释的过氧化物酶-链酶卵白素溶液，室温孵育1小时，PBS洗3次；0.01%DAB显色，流水冲洗；苏木素复染、分化、常规脱水、透明、封固。以正常鼠IgG替代一抗作阴性对照。(2)MVC定量方法：以与背景明显有别的任何一个棕色的内皮细胞或细胞丛结构作为一个血管；只要结构不相连续，分枝结构也作为一个血管。先在低倍镜(5×)下全面观察切片以确定肿瘤内血管最高密度区，这些血管高密度区可出现于肿瘤内任何部位，但较多位于癌的浸润边缘。血管较少的硬化区及与良性组织邻接区不作为血管计数区。在200倍(20×10,0.739 mm²/每视野)视野下计数5个血管最高密度区的MVC。该病例的MVC以这5个区域血管数的均数表示。

　　4．统计学处理: MVC与不同临床病理因素之间关系采用方差分析，生存曲线采用Kaplan-Meier法计算并作时序检验，Cox比例风险模型评估影响生存的各变量，逐步回归分析MVC与临床转归之间关系，以P＜0.05为具有统计学意义。所有统计处理均由SAS 6.1.1分析系统完成。

结果

　　1．胃癌组织中的MVC： 胃癌组织中的所有毛细血管、小静脉和小动脉的内皮细胞均呈抗F-ⅧRAg抗体染色反应阳性（图1，2），而正常鼠IgG对照组未见血管内皮染色。肿瘤内MVC分布呈异质性，在癌组织浸润前缘较密集，而在硬化坏死区，则甚稀疏。131例胃癌的MVC 从3.0～50.0个不等（平均值为16.4±8.5）。

　　2．MVC 与临床病理因素之间关系（表1）：由表1看出，MVC 与肿瘤的浸润深度有明显关系，当癌肿局限于粘膜层或粘膜下层时，其MVC较少，当浸及肌层或更深层时，MVC明显增加；发生淋巴结转移或远处转移患者的癌组织内MVC明显高于无转移者；同时，MVC也随TNM分期而增加。但MVC 与肿瘤组织学分级和生长方式之间无明显关系。

表1　MVC与临床病理因素之间关系

因素	例数	MVC(个)			P
		±s	中位数	范围
浸润深度
M、Sm	43	12.6±6.5	12.0	3.0 -32.0
Pm、SS	26	18.3±10.2	16.5	3.0-50.0	＜0.01
Se、Sei	62	18.2±8.1	17.0	6.0-42.0
组织学分级
Ⅰ	25	15.0±7.3	13.0	5.0-29.0
Ⅱ	39	15.8±8.3	14.0	3.0-40.0	＞0.05
Ⅲ	41	15.8±9.0	14.0	4.0-50.0
Ⅳ	26	19.5±8.7	19.0	5.0-42.0
生长方式
膨胀型	54	15.0±7.0	14.0	3.0-33.0	＞0.05
浸润型	77	17.3±9.3	16.0	3.0-50.0
淋巴结转移
阴性	51	13.2±6.5	13.0	3.0-33.0	＜0.01
阳性	80	18.4±9.0	17.0	3.0-50.0
其他转移
阴性	116	15.7±7.7	14.0	3.0-42.0	＜0.05
阳性	15	21.5±12.1	18.0	5.0-50.0
TNM
Ⅰ	39	13.4±6.5	13.0	3.0-31.0
Ⅱ	30	16.4±7.3	15.0	5.0-33.0	＜0.01
Ⅲ	45	17.4±8.4	16.0	4.0-42.0
Ⅳ	26	21.3±10.1	19.0	5.0-50.0

　　注：M:粘膜层; Sm:粘膜下层; Pm:固有肌层; SS:浆膜下层; Se:穿透浆膜层;Sei:侵及邻近组织或脏器 　　3．MVC 与预后关系: 112例行胃癌根治术的患者MVC均值为16.1±8.8个，以等于16.0个为取舍点将患者划分为高MVC 组（MVC≥16.0个）和低MVC 组（MVC＜16.0个）。术后5年内出现癌肿复发者共52例，占46.4%（52/112）。其中高MVC 组的复发率为58.5%（38/65），低MVC 组为29.8%（14/47），两者之间差别有显著性意义（P＜0.01）。采 用Kapaln-Meier法对两组患者5年生存率进行比较，结果低MVC 组预后明显优于高MVC 组［时序检验， P＜0.05（图3）］。采用逐步logistic回归，求得胃癌根治术后5年生存率与MVC 关系如下：P=e^{1.6231－0.1036*MVC}1+e^{1.6231－0.1036*MVC}（其中P为5年生存率）。

　　4．影响胃癌预后的多因素分析: 应用Cox比例风险模型，对可能影响胃癌预后的多种因素进行分析（表2），结果：浸润深度、淋巴结转移及MVC 均是独立的预后因素。在这些参数中，淋巴结转移是预期总体生存率的最重要因子，其次是浸润深度和MVC。

图3　根治术后的生存率

表2　影响胃癌预后因素的Cox's模型分析

讨论

　　治疗胃癌最有效的方法是彻底手术,切除原发肿瘤和清扫有关淋巴结。早期胃癌多能经手术治愈，但超过半数的进展期胃癌患者则死于术后肿瘤复发。对有远处转移的患者，肿瘤的根治性切除已不可能，此期胃癌的预后常受手术后残留癌的影响。而接受根治术的进展期胃癌患者的生存则取决于肿瘤本身的生物学特性，若能预测可能有不良预后的病例是有临床意义的。本研究旨在对新生血管形成在胃癌预后中的重要性进行研究。

　　最近几年，新生血管形成在肿瘤进展中的重要性受到广泛关注，并已在人类的某些肿瘤中得到证实^［1～3］。在乳癌、卵巢癌，MVC、生存率及复发之间有明显相关性^［3～5］，MVC 是一个有意义的预后指标。然而，有关新生血管形成在反映胃癌生物学特性及预后中作用的报道甚少。我们对胃癌研究发现：MVC 与胃癌浸润深度有关，当癌肿局限于粘膜或粘膜下层，体积尚小时，其所需血供也相对较小，因而MVC较少。而当癌肿浸及肌层或浆膜层时，其所需血供骤增，MVC明显增多；胃癌患者发生远处转移和淋巴结转移时MVC明显高于无转移者。而浸润深度、淋巴结转移及远处转移三者恰恰是决定肿瘤TNM分期的主要指标。同时，本研究也证实TNM分期与MVC有关，进展期胃癌的MVC 高于早期胃癌，提示MVC可反映胃癌的生物学行为。

　　Liotta等^［2］发现，较多的血管数量不仅会增加肿瘤细胞进入血液循环的机会，而且新形成的毛细血管的片段状基底膜容易渗漏，易为肿瘤细胞穿透，从而为浸润转移创造了条件。本研究资料也肯定了胃癌中MVC 与转移之间的关系，MVC多者转移发生率高。

　　本研究发现，高MVC 者根治术后复发率高，预后差。从Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型获得的信息看，在胃癌中，肿瘤的新生血管化程度也与总体生存率极为有关。这些结果肯定了肿瘤新生血管形成在预测胃癌预后中的意义。

　　总之,我们认为,本回顾性研究具有以下的实用意义：（1）应用免疫组织化学方法,在石蜡切片上检测肿瘤的血管化程度,有助于识别高危复发患者及预后不佳者。（2）某些抗血管形成药物在抗肿瘤治疗中已显示了良好前景，分析肿瘤的血管化程度可作为评价抗肿瘤血管药物疗效的一个有效指标。（3）测定肿瘤内MVC，并利用公式初步估计患者的5年生存概率。假如这一公式能在更大样本上得到验证，有可能将MVC 加入其它的胃癌预后指标中去，共同指导术后辅助治疗的实施。

图1 低分化腺癌，微血管内皮细胞F-ⅤⅢRAg染色，苏木素衬染 ×200

2 高分化乳头状腺癌，微血管内皮细胞F-ⅤⅢRAg染色，苏木素衬染 ×200

参考文献

　　1Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst,1990, 82:4-6.

　　2Liotta LA, Steeg PS, Stetle-Stevenson WJ, et al. Cancer metastasis and angiogenesis: an imblanance of positive and negative regulation. Cell,1989, 64:327-336.

　　3Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis: correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med, 1991, 324:1-8.

　　4Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early breast carcinoma. J Natl Cancer Inst,1992, 84:1875-1887.