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四种P-糖蛋白在胃癌组织中表达的研究

四种P-糖蛋白在胃癌组织中表达的研究

细胞与分子免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学

作者:范淼 倪灿荣 曹金龙 蔡清泉

单位:范淼(解放军第455医院病理科,上海200052);曹金龙(解放军第455医院病理科,上海200052);蔡清泉(解放军第455医院病理科,上海200052);倪灿荣(第二军医大学病理学教研室)

关键词:P-糖蛋白;胃癌;免疫组化;催化信号放大系统;p53蛋白

  摘要:目的了解术后胃癌的多药耐药性与胃癌组织中P-gp过量表达的关系。方法利用免疫组化方法,以4种抗不同亚型P-gp(C494,MRK16,JSB1和C219)的单克隆抗体(mAb),以及4种不同抗P-gpmAb的混合抗体和抗p53蛋白mAb,分别检测66例胃癌术后石蜡包埋组织中P-gp和p53的表达(其中16例为冰冻切片)。结果P-gp呈中等或高度表达(占40%~70%)。依次为:C494(75.75%,50/66),JSB1(62.12%,41/66),MRK16(48.49%,32/66)和C219(36.36%,24/66)。4种抗P-gpmAb的混合物的阳性检出率为78.79%(52/66),抗p53蛋白mAb的阳性检出率为60.61%(40/66)。4种抗P-gpmAb的混合物与抗P-gpmAbC494(G=0.90,P∨0.00001);抗P-gpmAbC494与抗JSB1mAb(G=0.60,P∨0.00005);抗MRK16mAb与抗C219mAb(G=0.64,P∨0.0001)均高度相关。石蜡和冰冻切片中P-gpC494和JSB1呈中度表达以上者阳性率基本一致;而C219和MRK16的阳性率相差则明显(P∨0.05)。p53蛋白的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(P∨0.002和P∨0.002),与MRK16和C219的表达也有相关性(P∨0.01和P∨0.05)。结论C494阳性表达率最高,可作为胃癌组织中耐药基因检测的标志物。P-gp的过量表达与p53蛋白的表达关系密切。

  中图号:R735.2 文献标识码:A 文章编号:1007-8738(2000)03-0264-04

Expression of P- glycoprotein in the gastric carcinoma tissues

  using a panel of four mAbs

FAN Miao CAO Jin-long CAI Qing-quan

  (Department of Pathology, The 455th Hospital of PLA, Shanghai 200052)

  NI Can-rong

  (Department of Pathology, The Second Medical University, Shanghai, 2000433, China)

  Abstract: Aim To understand relationship between multidrug resistance of post operative gastric cancer and P- gp overexpression in the gastric cancer tissues. Methods Paraffin sections from 66 cases of gastric carcinoma(16 cases of them were frozen sections) were immunohistochemically(IHC) analyzed using a panel of 4 different anti P- glycoprotein monoclonal antibodies (mAbs) composed of C494, MRK16, JSB 1 and C219. Cocktail of the 4 mAbs and mAb against p53 protein were also used. Results Moderate to high levels of P- glycoprotein were detected in 40% to 70% of gastric cancer. The positive rate of C494 (75.75% , 50/66)was higher than those of JSB 1(62.12% ; 41/66), MRK16(48.49% , 32/66)and C219(36.36% , 24/66). The positive rate of cocktail of the 4 anti P- glycoprotein antibodies was 78.79% (52/66). The positive rate of p53 protein was 60.61% (40/66). The positive expression of cocktail of the 4 anti P- glycoproteins was closely related to 4 anti P- gly coprotein C494(G=0.90, P∨ 0.00001); The positive expression of C494 was closely related to JSB 1(G=0.60,P∨ 0.00005). The positive expression of MRK16 was closely related to C219(G=0.64, P∨ 0.0001). There were similar positive expressions of C494 and JSB 1 between corresponding paraffin and frozen sections, but different ones between C219 and MRK16. Expression of p53 protein was closely related to C494(P∨ 0.002), JSB 1 (P∨ 0.002), MRK16 (P∨ 0.01) and C219 mAbs(P∨ 0.05). Conclusion The positive expression of C494 was the highest and could be as a marker for multidrug resistance gene assay. Overexpression of P- glycoprotein was closely related to p53 protein.

  Keywords: P- glycoprotein; gastric cancer; IHC; CSA; p53 protein ▲

  胃癌的发病率很高,大多数患者被确诊后已是中晚期,并可远距离转移,复发率高,预后较差;另一方面,因该肿瘤对化疗药物不敏感,疗效仅15%~20%,较其它肿瘤的疗效(40%~70%)低。多柔比星(epidoxorubicin)或鬼臼乙叉甙(etoposide/VP16)是胃癌患者术后常用的化疗药,疗效最高,但最终的治疗效果较差,这可能与天然或继发多药耐药(multidrugresistance,MDR)的产生,P-糖蛋白(P-gp)的过量表达及其它耐药机制的启动有关。

  许多研究者〔1,2〕已经在该肿瘤中检测到MDR1mRNA的表达,应用斑点杂交检测的阳性率为41%~80%;而用免疫组化法(immunohistochemicalstaining,IHC)检测P-gp的不同亚型(C219,C494,MRK16和JSB1)的阳性率仅为26%~42%。然而,几种抗P-gpmAb的混合使用,可使P-gp的检出阳性率更准确,其多肽更全面,更能反映出肿瘤组织中P-gp的含量。我们应用4种抗P-gpmAb的  混合物,做催化信号放大系统免疫组化(catalyzedsignalamplificationimmunohistochemicalstaining,CSAIHC)染色,检测了P-gp4个亚型(C494,C219,MRK16和JSB1)在66例胃癌术后石蜡包埋组织切片(其中16例同时采用冰冻切片)中的表达,并与抗P-gp各个亚型的mAb检测的敏感性相比较,观察了P-gp及各个亚型的表达与p53蛋白表达的相关性。

  1 材料和方法

  1.1材料66例胃癌组织标本为我院1994年~1998年外科手术切除标本。患者术前均未经过化疗。标本经100mL/L中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片分别做HE和IHC染色。其中16例为液氮速冻保存的胃癌标本,临用前解冻后用40mL/L多聚甲醛固定,250g/L蔗糖浸泡24h,8μm厚恒冷箱冰冻切片后,于80℃保存备用。66例胃癌中,男52例,女14例,年龄34~75岁(平均58.75岁)。其中高分化腺癌10例,中等分化腺癌30例,低分化腺癌22例(有2例为印戒细胞癌),未分化腺癌4例。有淋巴细胞转移者38例,无淋巴细胞转移者28例;有随访结果者36例,其中术后生存时间≥3年者20例(55.55%),∨3年者16例(6例术后3月内,因肝内或腹膜内转移而死亡),占44.44%(包括3例未分化腺癌,9例低分化腺癌和4例中等分化腺癌)。P-gp(JSB1)购自武汉博士德公司,P-gp(MRK16)购自迈新公司。P-gp(C494和C219),抗p53(pAb1801)和CSAKit购自丹麦Dako公司。

  1.2方法

  1.2.1CSAIHC染色石蜡切片脱蜡至水,用0.01mol/LpH7.4PBS洗3次×3min。30mL/LH2O2室温处理20min,同前洗涤。微波抗原修复〔3〕(98℃10min)后,自然冷却,PBS洗3次×3min,依次滴加适当稀释的抗P-gp和抗p53mAb(37℃1h,PBS洗3次×3min),生物素化马抗鼠IgG(1∶300,37℃30min,PBS洗3次×3min),第1次HRP标记的链霉亲和素(1∶50037℃30min,PBS洗3次×3min),酪胺标记的生物素(0.007mmol/L37℃15min,PBS洗3次×3min)及第2次HRP标记的链霉亲和素(1∶1000,37℃30min,PBS洗3次×3min)。如有必要可循环上述步骤数次,以达到信号的最佳放大。最后用0.5g/LDAB+0.3mL/LH2O2显色(8~10min),流水洗终止反应,以苏木素衬染后,经洗涤、微波兰化,常规树胶封片。实验中的阳性对照均以CASkit盒内配置的阳性标本片为标准;阴性对照用无关血清或PBS代替抗P-gpmAb和抗p35mAb。

  1.2.2结果判断标准和统计学处理〔4〕根据染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记为0~3分。染色深度:以多数细胞的呈色反应为标准,黄色者为1分,棕色者为2分,深棕褐色者为3分,不着色者为0分。阳性细胞数:50%为1分,50%~80%为2分,∧80%为3分,无细胞染色者为0分。并根据上述两项指标的积分数分为4级,即:阴性(-)为0分,弱阳性(+)为1~2分,中等阳性(++)为3~4分,强阳性(+++)为5~6分。统计学处理采用2检验和t检验。

  2 结果

  2.1P-gp和p53的分布四种P-gp主要分布于肿瘤细胞的细胞浆内,仅4例核内有C219表达。C494除在胞浆内表达外,在细胞核内也有少量表达。但冰冻切片中,未发现核内表达的病例(图1A~D)。p53全部在肿瘤细胞核内表达(图2)。癌周息肉和正常粘膜上皮P-gp表达在细胞浆内。

  2.2各种P-gp在胃癌组织中的表达在66例胃癌中,用4种抗P-gpmAb的混合物检出的阳性率最高(78.79%,52/66);4种抗P-gpmAb单独应用时的检出率依次是:C494为75.76%(50/66),JSB1为62.12%(41/66),MRK16为48.49%(32/66)和C219为36.36%(24/66)。总体上看,中度阳性(++)和高度阳性(+++)表达占40%~70%。

  2.3四种抗P-gpmAb检出的阳性符合率四种抗P-gpmAb的混合物检出P-gp的阳性率与分别应用抗P-gp4个亚型mAb检出C494,JSB1,MRK16和C219的阳性率均高度相关,分别为:

  G=0.90,P∨0.00001;G=0.60,P∨0.01;G=

  0.64,P∨0.005。

  2.4P-gp4个亚型和p53蛋白的表达表2为石蜡和冰冻切片中4个P-gp亚型表达的阳性例数。结果表明,在石蜡和冰冻切片中,P-gpC494和JSB1均呈中等以上强度,分别为:G=1,P∨0.00001和G=0.58,P∨0.01;而C219和MRK16在冰冻切片中的阳性检出率分别为75%和81%;在石蜡切片中的阳性检出率分别为45%和45%,二者相关显著(P∨0.05)。P-gp和p53蛋白的表达见表3和表4。从表4中可以看出,P53的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(分别P∨0.001和P∨0.002);与MRK16和C219的表达也有相关性,分别为P∨0.01和P∨0.05。

  图1CSAIHC法检测4种P-gp在胃癌组织中的表达

  表1各种P-gp在胃癌组织中的阳性表达

Region Pgp* C494 MRK16 JSB-1 C219
- + ++ +++ - + ++ +++ - + ++ +++ - + ++ +++ - + ++ +++
Tumour areas 14 12 31 9 16 11 23 16 24 12 14 6 15 9 21 11 42 10 11 3
Transition areas 46 16 3 1 50 10 6 0 56 8 2 0 51 11 3 1 58 6 2 0
Mucosa round 56 8 2 0 59 6 1 0 62 4 0 0 60 5 1 0 65 1 0 0
tumour tissue                                        

图2p53在胃癌组织中的表达(CSAIHC,×132)

  表2冰冻和石蜡切片中4种P-gp亚型的表达

Expression intensity C94 JSB-1 C219 MRK16
PRF FZ PRF FZ PRF FZ PRF FZ
- 3 2 5 4 9 4 7 3
+ 1 2 2 2 1 2 1 2
++ 8 5 4 8 4 6 3 6
+++ 4 7 5 2 2 4 3 5

  表366例胃癌组织中P-gp和p35蛋白的表达

Antibody used

Postitive cases(%) Negative cases(%)
  AntiC494mAb 50(75.76) 16(24.24)
  AntiJSB1mAb 41(62.12) 25(37.88)
  AntiC219mAb 24(36.36) 42(63.63)
  AntiMRK16mAb 32(48.49) 34(51.51)
  Antip53mAb 46(69.69) 20(30.30)

  表466例胃癌组织中P-gp与p35蛋白表达的相关性

     
  AntiC494/p53mAb 42/46(91.3)a 8/20(40)
  AntiJSB1/p53mAb 36/46(78.26)a 5/20(25)
  AntiMRK16/p53mAb 28/46(60.86)b 4/20(20)
  AntiC219/p53mAb 22/46(47.82)b 2/20(10)

  3 讨论

  大多数研究结果显示,P-gp蛋白在胃癌组织中的表达阳性率很低,其中C219,MRK16和JSB1的表达率分别为26%,42%和40%〔5,6〕。本研究中,P-gp表达的阳性率高于文献报道,这可能与IHC染色过程中采用微波抗原修复和敏感的CSAIHC法有关。Tomonage等〔8〕表明,胃癌组织中MDR1的表达仅20%,而多药耐药基因相关蛋白(MRP)的表达则很高。体外培养的细胞无MDR1的表达,提示胃癌组织中MDR1是否表达对癌细胞的耐药性无直接的相关性,可能还存在其它的耐药机制。但本文的结果显示,C494的表达阳性率达75.76%,与Lacueva等〔8〕的研究结果较为一致,提示胃癌组织和其它肿瘤组织类似,MDR1起主要作用。

  P-gp在石蜡切片和冰冻切片中的阳性率基本一致,因此,石蜡切片完全可以作为MDR1的检测标本,尤其是对C494的检测更为理想。MRK16在石蜡切片中的表达较冰冻切片中低。

  P-gp的表达与突变型p53蛋白的累积之间的相关性存在较大差异。在乳腺癌中,P-gp和p53的表达密切相关,而在妇产科肿瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病中则无相关性。Oka等〔11〕对40例结肠癌的研究发现,p53和P-gp的共同表达关系密切。本研究在66例胃癌组织中,P-gp4个亚型的阳性表达均与p53的表达关系密切。MDR1基因表达受多种因素的影响。重金属、生长因子及活化的癌基因等,均可通过活化磷酯酶C而使MDR1启动子的活性增加。突变型p53功能的丧失可引起基因组不稳定,这种内在特性可能就是MDR1在高度恶性细胞内扩增,最终表现为MDR的原因,们已在结肠癌、乳腺癌及胃癌中得到证实。■Fig 1 Expressions of 4 P- glycoproteins in gastric cancer tissues by CSA IHC A: Expression of MRK16(× 66); B: Expression of C494(× 330); C: Expression of JSB 1(× 330); D: Expression of C219(× 132).

  Fig 2 Expression of p53 protein in gastric cancer tissues (CSA IHC, × 132)

  Tab 1 Positive cases of 4 P- gp expressions in the 66 cases ofgastric cancer tissues (n=66) Pgp C494 MRK16 JSB 1 C219 Region

  Tab 2 Positive cases of 4 P- gp expressions in frozen(Fz)tissues and paraffin (PRF) embedded tissues (n=16) Expression C494 JSB 1 C219 MRK16 intensity PRF FZ PRF FZ PRF FZ PRF FZ

  Tab 3 Positive rates of P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues Antibody used Positive cases(% ) Negative cases(% )

  Tab 4 Correlation between P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues ─ ─ Antibody used + /+ (% ) + /- (% )

  a: The p53 expression was highly consistent with C494 and JSB 1 ex presions (P∨ 0.01 and P∨ 0.002, respectively);b: The p53 expression was significantly correlated with the MRK16 and C219 expressions(P∨ 0.01 and P∨ 0.05, respectively).

  作者简介:范淼,女,37岁,技师上海市淮海西路338号, Tel.(021)62800157

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收稿日期:1999-08-03

  修回日期:1999-12-21


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