肝癌及其癌前病变组织端粒酶活性检测的临床意义探讨

中国普外基础与临床杂志 2000年第4期第7卷 临床研究

作者：王伟　杨善民　李新丰　黄长玉

单位：王伟 李新丰（福建医科大学附属第二医院普外科　泉州　362000）；杨善民（厦门大学抗癌研究中心　厦门　361000）；黄长玉（福建医科大学附属协和医院　福州　350005）

　　关键词： 肝癌；癌前病变；端粒酶

　　【摘要】　目的　探讨端粒酶检测用于早期诊断原发性肝癌的可能性。方法　采用TRAP法分别检测22例原发性肝癌及癌旁组织标本、12例肝硬变组织、6例腺瘤样增生组织和10例正常肝组织中的端粒酶活性。结果　22例原发性肝癌中有20例端粒酶表达阳性，阳性率为90.9%； 22例癌旁组织中有14例阳性，阳性率为63.6%； 12例肝硬变组织中有10例阳性，阳性率为83.3%； 6例腺瘤样增生组织中5例阳性，阳性率为83.3%； 而10例正常肝组织的端粒酶检测均为阴性。结论　端粒酶活性表达可能发生在肝组织癌变过程中，并在其中扮演重要角色，因此端粒酶有可能成为肝癌早期诊断以及疗效和预后判断的一种标志物。

　　【中图分类号】　R735.7　　　【文献标识码】　A

　　【文章编号】　1007-9424(2000)04-0246-03

THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF TELOMERASE ACTIVITY IN LIVER CANCER AND PRE-CANCEROUS LESION

WANG Wei，LI Xin-feng

　　（Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital, Fujian University of Medical Sciences, Quanzhou 362000）

　　YANG Shan-min

　　【Abstract】　Objective　To investigate the variety of telomerase activity in the course of liver cancer development, and the possibility of using telomerase as a marker of HCC. Methods　Human liver specimens, comprising 22 HCC and adjacent peritumoral tissues, 12 liver cirrhosistissues, 6 nodulat regenerative hyperplasia(NRH) tissues and 10 normal liver tissues, were examined for telomerase activity by TRAP assay based on PCR. Results　Twenty of 22 HCC and 14 of 22 adjacent tissue specimens were positive for telomerase activity with a positive rate of 90.9% and 63.6% respectively. Ten of 12 liver cirrhosis tissues were positive with a positive rate of 83.3%. 5 of 6 NRH were positive with a positive rate of 83.3%. Telomerase activity was negative in 10 normal liver tissues. Conclusion　Telomerase may occur in the progress of hepatocarcinogenesis. Telomerase can be used as a tumor marker of hCC.

　　【Key words】　Liver cancer　　Precancer lesion　　Telomerase

　　原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其病死率在所有恶性肿瘤中居第2位。肝癌的病因迄今尚不清楚，目前认为肝硬变、病毒性肝炎、腺瘤增生等是肝癌的癌前病变，如果能对原发性肝癌早期发现，早期诊断和早期治疗，则能进一步改善肝癌的预后，提高患者的生存率。近年研究表明，大多数恶性肿瘤细胞中均有端粒酶活性表达，而正常人体组织中全部不表达(人生殖细胞、淋巴细胞造血干细胞、子宫增生期内膜等除外)^〔1，2〕，由此提示它可能成为新的恶性肿瘤诊断标志物和肿瘤治疗的新靶点。本研究采用TRAP方法对原发性肝癌、肝硬变、腺瘤样增生组织和正常肝组织进行了端粒酶活性检测，研究端粒酶活性在正常肝组织、癌前病变及肝癌进程中的变化，以探讨端粒酶检测对肝癌早期发现、早期诊断、疗效判定和预后估计的价值。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　全部组织标本均取自我院1998年7月至1999年5月期间手术切除标本。标本均在切除后半小时内采集，取0.5～1.0 g组织放置小离心管内，迅速用液氮冷冻管底部，置-80℃冰箱贮存。

　　1.2　方法

　　1.2.1端粒酶提取　采有Kim等^〔2〕报告的方法。

　　1.2.2端粒酶检测　用TRAP法检测端粒酶活性，反应体系25 μl，含2.5 μl端粒酶缓冲液，2.5 μl dNTP，2.5 μl Ts引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，2.5 μl Taq酶，0.2 μl α³²P-dATP，加6 μg组织蛋白，20℃反应30分钟，完成端粒酶介导的Ts引物延伸。反应产物90℃作用3分钟以灭活端粒酶活性，后加入1.25 μl CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)，混匀后于PCR循环仪上进行扩增，循环参数为94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，循环31次，最后在72℃继续反应3分钟。每次检测以6 μg小鼠睾丸素为阳性对照，阴性对照为反应液中不加组织提取物，取20 μl PCR产物于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶干燥并行放射自显影观察。

　　1.3　统计学处理

　　采用χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　肝病变组织中端粒酶的表达

　　阳性肝组织产物经放射自显影可见间隔6 bp的梯形信号。22例肝癌组织中20例端粒酶表达阳性，阳性率为90.9%； 22例癌旁组织中有14例端粒酶表达阳性，阳性率为63.6%，经组织学检查证实端粒酶阳性的癌旁组织均伴有结节性肝硬变；12例肝硬变组织中10例端粒酶表达阳性，阳性率为83.3%； 6例腺瘤样增生组织中有5例端粒酶表达阳性，阳性率为83.3%； 10例正常肝组织端粒酶检测均为阴性，见图1，2。

图1　肝组织标本中端粒酶活性表达

　　-：小鼠睾丸素为阳性对照； +：端粒酶裂解缓冲液为阴性对照； 1：原发性肝细胞癌组织； 2：肝癌癌旁组织； 3：肝硬变组织

图2　不同肝组织标本中端粒酶活性表达

　　-：小鼠睾丸素为阳性对照； +：端粒酶裂解缓冲液为阴性对照； 1：肝硬变组织； 2：腺瘤样增生组织； 3：原发性肝细胞癌组织； 4： 正常肝组织

　　2.2　端粒酶表达与临床病理特征的关系

附表　肝癌及其癌旁组织端粒酶活性检测结果比较(临床病理参数分析)

　　由附表可见，肝癌的临床病理分期、肿瘤大小、有无HBsAg感染、有无包膜及肿瘤数目均与端粒酶活性表达无关，各组内端粒酶活性检测率差异无显著性意义(P＞0.05)。不同病理分化、肿瘤大小、肿瘤数目及有无包膜的肝癌癌旁组织端粒酶检出率无显著性差异(P＞0.05)； HBsAg阳性的癌旁组织端粒酶检出率高于HBsAg阴性者，两者差异有显著性意义(P＜0.05)。

　　3　讨论

　　3.1　端粒酶活性检测的临床意义

　　端粒酶是一种核酶核蛋白复合酶，能以自身RND为模板反转录合成，以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短，维持端粒长度。在高等生物的正常体细胞中，端粒酶处于失活状态，而在细胞恶变时端粒酶则被激活^〔3〕，提示端粒酶再激活参与了细胞的癌变过程，并在其中扮演重要角色^〔4〕。本研究中，原发性肝癌端粒酶活性检测阳性率为90.9%(20/22)，正常肝组织中端粒酶活性不表达，与国外文献报道相符，但癌旁组织阳性率(63.6%)远高于文献〔5〕报道。我们认为癌旁组织阳性率高的原因如下： ①由于本组癌旁组织有16例伴有结节性肝硬变，而且14例阳性标本均为肝硬变组织，这符合文献及我们研究得出的“在大多数肝硬变组织中端粒酶表达出一定活性”的结论。根据放射显影图谱显示，肝硬变组织中的端粒酶阳性表现出的电泳带强度明显弱于肝癌组织中端粒酶活性表达，也从另一侧面揭示了端粒酶活化在肝癌早期癌变过程中起着重要作用^〔6～9〕。②可能是癌旁已经出现微小肝癌转移灶，尚不能被病理组织学识别。因此，对于癌旁端粒酶阳性患者不能排除潜在肝内转移，应加强随访，严密观察肝内转移情况。③癌旁组织存在着癌前病变组织，包括不典型增生改变，它所具有的少量肿瘤细胞尚不能被病理学发现，但在端粒酶检测中表达出活性，这也提示端粒酶活性检测可能成为一种预测肝癌发生的手段。本研究中，端粒酶活性与原发性肝癌的大小、数目、有无包膜、分化程度以及有无HBsAg感染无关，与国外文献报道基本一致。提示端粒酶活化普遍存在于肝癌组织中，与肝癌病理分期无必然联系，这对于诊断高分化的小肝癌有临床应用价值^〔10〕。本研究中，多结节、无包膜、合并有HBsAg感染的癌旁组织端粒酶活性高于单结节、有包膜、无HBsAg感染者，这提示癌旁端粒酶活化可能与原发性肝癌的预后有关。

　　3.2　癌变过程中端粒酶活性的变化

　　1995年Bednarek等^〔11〕报道，用化学物质诱导小鼠乳头状上皮瘤发生，端粒酶活性随着肿瘤发展过程逐步升高。1996年Tsujiuchi等^〔5〕采用缺乏胆碱的饲料喂大鼠(F344)，在第50周和第70周饮食缺乏胆碱的大鼠肝脏产生增生性结节，在增生性结节或实验性肝癌都有较高端粒酶活性。1997年Ohnishi等^〔6〕发现仓鼠颊囊上皮用DMBA处理诱发的上皮癌和癌前病变都具有端粒酶活性。以上实验均表明人们希望在动物实验中观察肿瘤发生过程中端粒酶的演变过程，想揭示端粒酶在恶性肿瘤发生的重要枢纽作用。在本研究中，人体肝硬变组织端粒酶阳性率为83.39%(10/12)，腺瘤样增生组织端粒酶阳性率为83.3%(5/6)。肝硬变和腺瘤样增生被认为是原发性肝细胞癌的癌前病变，因此研究端粒酶在正常肝组织→癌前疾病→肝癌过程中的不同表达是很有临床意义的。目前认为癌前病变组织端粒酶阳性可能有以下两种情况： ①癌前病变组织存在少量尚不能被病理组织学所识别的肿瘤细胞，也许正是这些具有端粒酶活性的肿瘤细胞能够无限分裂、增殖，从而导致肿瘤的形成； ②存在端粒酶再激活的增生细胞。这提示病变组织已经历了严重的细胞坏死和多次的细胞更新，端粒酶的再激活赋予增生细胞永生能力，能为细胞进一步积累基因突变→恶性变或恶性肿瘤克隆的筛选提供了必要的条件。因此我们认为，倘若癌前病变组织中组织学正常，其端粒酶活性细胞是正在恶性转化的细胞，提示这种细胞的端粒酶再激活活性的检测可以帮助预测肿瘤早期发生。本研究中，我们在尽可能相同的实验条件下，将已用TRAP法实验检测有端粒酶活性的肝硬变组织、腺瘤样增生组织和肝细胞癌组织，随机选择几例，予重复实验并在同一张X光片上放射显像。结果显示，肝硬变组织及腺瘤样增生组织的阳性电泳带强度明显弱于肝癌组织的阳性电泳带，也就是说端粒酶活性在肝癌组织中的表达明显强于肝脏的癌前癌变组织。由此我们推测端粒酶活性随着肝硬变、腺瘤样增生等癌前病变的发展而逐渐增高，并提示端粒酶的活化可能在原发性肝癌癌变过程中起着重要作用。因此，对端粒酶阳性的肝硬变和慢性肝病患者进行密切随访，可能有助于肝癌的早期发现。同时也使我们产生了一个新的思路，即如果我们能以端粒酶为靶点，研制出某种抑制剂，通过抑制癌细胞端粒酶活性或直接抑制端粒的延长和稳定，而使细胞无法连续增殖，继而进入衰老、死亡，我们将最终达到治疗癌症的目的，这也是目前研究的又一热点。

　　【作者简介】　王伟(1972年-)，男，福建省泉州市人，医学硕士，住院医生，主要从事肝胆外科临床工作。

参考文献

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　　3，Chadenean C, Hay K, Hirte HW, et al. Telomerase activity associated with acquistion of malignancy in human colorectal cancer 〔J〕. Cancer Res, 1995; 55(12)∶2573

　　4，Counter CM, Cuptal J, Harley CB, et al. Telomerase activity in normal leukcoytes and in hematologic malignancies 〔J〕. Blood, 1995; 85(9)∶2315

　　5，Tsujiuchi T, Tustsumi M, Kido A, et al. Increase telomerase activity in hyperplastic nodules and hepatocellular carcinomas induced by a choline-deficient L-amino acid-defined diet in rats 〔J〕. Japan J Cancer Research, 1996; 87(11)∶1111

　　6，Ohnishi M, Univ G, Med S, et al. Inhibitory effects of dietary protocatechuic acid and costunolide on 7, 12-dimethybenz ［a］ anthracene-induced hamster cheek pouch carcinogenesis 〔J〕. Japan J Cancer Research, 1997; 88(2)∶111

　　7，Takara H, Nakanish T, Kitamoto M, et al. Telomerase activity in human liver tissues; comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinoma 〔J〕. Cancer Ris, 1995; 55(13)∶2734

　　8，Kojima H, Yokosuka F, Imazeki F, et al. Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease 〔J〕. Gastroenterology, 1997; 112(2)∶493

　　9，Nakashiv K, Kitamoto M, Takara H, et al. Significance of telomerase activity of small differentiated hepatocellular carcinoma 〔J〕. Int J Cancer, 1997; 74(2)∶141

　　10，Miura N, Horikawa I, Nashimoto H, et al. Progressive telomerase shortening and reactivation during hepatocellular carcinogenesis 〔J〕. Cancer Genet Cytogent, 1997; 93(1)∶56

　　11，Bednarek A, Budunova I, Slaga TJ, et al. Increased telomerase activity in mouse skin premalignant progression 〔J〕. Cancer Res, 1995; 55(2)∶4566

(1999-09-17收稿，1999-12-30修回)