血管内皮生长因子表达和肝癌细胞周期启动的关系

中国普外基础与临床杂志 1999年第6期第6卷 基础与实验研究

作者：张晓实　姚榛祥　陶小红

单位：重庆医科大学临床学院普外科(重庆　400016)

　　关键词： 血管内皮生长因子；细胞周期；肝癌

　　摘要　为了探讨血管内皮生长因子(VEGF)表达与肝癌细胞增殖的联系。采用同步化环境G₀期的Hep G₂细胞用TPA诱导启动细胞周期并用c-jun反义寡核苷酸阻断细胞周期，观察VEGF表达变化。结果显示： G₀期Hep G₂不表达VEGF，伴随细胞周期启动VEGF表达，c-jun反义寡核苷酸在使Hep G₂细胞周期停滞于G₀/G₁期的同时使VEGF表达下调。由此表明： 在Hep G₂细胞株VEGF表达和细胞周期启动联动，提示二者受同一信号通路调节，VEGF表达有可能成为肝癌细胞增殖的标志物。

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE EXPRESSION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR AND INITIATION OF CELL CYCLE IN HEPATOMA CELL LINE HEP G₂

Zhang Xiaoshi, Yao Zhenxiang, Tao Xiaohong.

　　Department of Surgery, College of Clinical Medicine, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016

　　Abstract　For research the relationship between the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and the cell proliferation. The expression of VEGF was evaluated while the cell cycle of hepatoma cell line Hep G₂, which was synchronized at G₀ phase with serum deprivation, and reinitiated with TPA and blocked with antisense oligonucleotides of c-jun. Results: Hep G₂ cell did not express VEGF at G₀ phase. TPA could induce the expression of VEGF as well as initiation of cell cycle. The antisense oligonucleotides of c-jun could prohibit the expression of VEGF and arrest the cell cycle at G₀ phase. Conclusion: The fact that the expression of VEGF accompanies the initiation of cell cycle suggests that they be regulated by the same singnal pathway, the expression of VEGF may be a marker indicating the proliferation of hepatoma cells.

　　Key words　　Vascular endothelial growth factor　　Cell cycle　　Hepatoma

　　在肝癌、肺癌等肿瘤组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达与增殖细胞核抗原(PCNA)表达正相关^〔1，2〕，本研究观察VEGF表达与细胞周期启动的关系，试图寻找二者的内在联系。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞培养

　　肝癌株Hep G₂(重庆医科大学蒋纪凯教授赠送)传代48小时后，换无血清的RPMI 1640培养基继续培养16小时，使细胞同步化于G₀期^〔3〕。用100 nm氟波酯(TPA)启动细胞周期，在0～4小时收获细胞。实验重复3次。

　　1.2　电穿孔法转染AP-1反义寡核苷酸

　　硫代磷酸化修饰的反义寡核苷酸序列如下^〔3〕： c-fos反义寡核苷酸：5′-CCGAGAACATCATCGTGG-3′，c-jun反义寡核苷酸： 5′-GCAGTCATAGAACAGTCC-3′，无关序列： 5′-ATCGCCTGTAGTGAACTG-3′，取电压0.220 kV，电容975 μF，电击时间16～18 mS。对数生长期细胞电穿孔转染后培养48小时，收获细胞。

　　1.3　流式细胞仪分析细胞周期

　　Western Blot分析VEGF、PCNA、Cyclin D₁、c-jun及c-fos表达： 裂解液(50 nmol/L TBS含1% triton X 100和PMSF 10 μg/ml)裂解细胞，每道上样100 μg蛋白质，10% SDS-PAGE分析VEGF、PCNA、Cyclin D₁、c-jun表达，8% SDS-PAGE分析c-fos表达。半干式电转印，5%脱脂奶粉封闭，NC膜分别与1∶300的抗VEGF 147抗体(Santa Cruz)、抗PCNA抗体(Zymed)、抗Cyclin D₁抗体(Zymed)、抗c-jun抗体(Santa Cruz)、抗c-fos抗体(Santa Cruz)工作液4℃孵育过液，依次加入生物素化二抗和亲和素结合的碱性磷酸酶，NBT/BCIP显色。

　　2　结果

　　2.1　细胞周期启动时c-jun、c-fos、VEGF、Cyclin D₁和PCNA表达

　　G₀期Hep G₂细胞用Western Blot均检不出c-jun、c-fos、VEGF、Cyclin D₁和PCNA，TPA诱导0.5小时后有c-jun、c-fos表达，见图1。从1小时起可检出VEGF和Cyclin D₁表达，VEGF表达持续4小时以上，Cyclin D₁表达持续1～3小时，PCNA从3小时起开始表达，见图2。

图1　细胞周期启动时c-jun、c-fos的表达

图2　细胞周期启动时VEGF、Cyclin D₁、PCNA的表达

　　2.2　AP-1反义寡核苷酸对VEGF、Cyclin D₁、PCNA、c-jun、c-fos瞬时表达的影响

　　c-jun和c-fos蛋白质表达被相应的反义寡核苷酸所抑制，c-jun反义核苷酸组的VEGF、PCNA表达被抑制，Cyclin D₁表达，而c-fos反义核苷酸组对VEGF、PCNA、Cyclin D₁表达的影响与无关序列组相同，见图3。

图3　AP-1反义寡核苷酸对VEGF、Cyclin D₁、PCNA表达的影响

　　P1： 无关序列； P2： c-jun反义寡核苷酸； P3： c-fos反义寡核苷酸

　　2.3　AP-1反义寡核苷酸对细胞周期分布的影响

　　c-jun反义寡核苷酸组G₀/G₁期细胞比例(57%)高于c-fos反义寡核苷酸组(35%)和无关序列组(31%)。

　　3　讨论

　　3.1　VEGF与细胞周期启动的相关性

　　G₀期Hep G₂细胞在TPA(100 nM)诱导下，0.5小时内检出c-jun、c-fos表达。1小时起即有Cyclin D₁表达，3小时起PCNA表达，由于PCNA是DNA多聚酶δ亚基，开始表达于G₁/S交界处，可以认为在Hep G₂细胞Cyclin D₁表达持续2小时以上则表明TPA已有效地启动G₀期Hep G₂细胞进入细胞周期。

　　细胞周期一旦启动，细胞内发生一系列生化事件，为DNA合成作准备，如RNA聚合酶增多，非组蛋白染色体蛋白表达等。我们观察到随着细胞周期启动，VEGF也表达，其意义可能在于Hep G₂细胞虽不表达VEGF受体，但VEGF诱导血管形成，使肿瘤细胞获得充分的营养和氧气，为细胞增殖创造有利的外部条件。

　　3.2　AP-1信号通路对VEGF表达、细胞周期启动的调节作用

　　有丝分裂信号主要通过ras/raf/MAPK通路转导到细胞核内，Hep G₂细胞转染c-jun反义寡核苷酸后出现G₀/G₁期停滞，提示c-jun对于推动G₀→G₁期过渡至关重要。虽然VEGF侧翼调控序列中含4个AP-1蛋白结合位点^〔4〕，TPA、生长因子能经ras/raf/MAPK通路介导VEGF表达^〔5〕，但PA-1调控VEGF表达的确切机理有待进一步实验证实^〔6〕。最近Yoshida等^〔7〕用TNF-α诱导血管内皮细胞表达VEGF，c-jun反义寡核苷酸并不能阻断TNF-α诱导血管内皮细胞表达VEGF，c-jun反义寡核苷酸并不能阻断TNF-α依赖的VEGF表达，提示AP-1调节VEGF表达可能存在细胞类型特异性。

　　本研究中c-fos反义寡核苷酸不影响Hep G₂表达VEGF和细胞周期启动，其原因可能是AP-1可由c-jun/c-jun同源二聚体和c-jun/c-fos异二聚体组成，阻断c-fos蛋白质表达不足以阻断AP-1功能^〔8〕。综上所述，笔者认为在TPA诱导Hep G₂细胞周期启动(G₀/G期)过程中，c-jun和Cyclin D₁发挥着重要的作用； TPA诱导的VEGF表达与c-jun表达相关，与Cyclin D₁表达同步，说明VEGF表达是Hep G₂细胞增殖的标志之一。如果VEGF构建表达是肝癌组织中VEGF主要来源，VEGF表达代表细胞增殖将有一定的应用价值，如在体预测肿瘤的增殖性，深化细胞周期调控的研究等。

　　参考文献

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　　3　Arts J, Grimbergen J, Bosma PJ, et al. Role or c-jun and proximal phorbol-12-myristate-13-acetate-(PMA)-responsive elements in the regulation of basal and PMA-stimulated plasminogen-activator inhibitor-1 gene expression on Hep G₂, Eur J Biochem, 1996; 241(2)∶393

　　4　Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. J Biol Chen, 1991; 266(18)∶11947

　　5　Kolch W, Martiny-Baron G, Kieser A, et al. Regulation of the expression of the VEGF/VPF and its receptors: role in tumor angiogenesis. Breast Cancer Res Treat, 1995; 36(2)∶139

　　6　Karin M. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem, 1995; 270(28)∶16483

　　7　Yoshida S, Ono M, Shono T, et al. Involvement of interleukin-8, vascular endothelial growth factor, and basic fibroblast factor in tumor necrosis factor alpha-dependent angiogenesis. Mol Cell Biol, 1997; 17(7)∶4015

　　8　Brusselbach S, Mohle-steinlein U, Wang ZQ, et al. Cell proliferation and cell cycle progression are not impaired in fibroblasts and ES cells laking c-fos, Oncogene, 1995; 10(1)∶79

(1999-01-14收稿，1999-03-23修回)