精蛋白异常及正常原发不育男性精蛋白2基因5′端GA重复区的研究(摘要)

中华泌尿外科杂志 1998年第12期第19卷 论著摘要

作者：李建平　张思仲　S.A.Krawetz

单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院医学遗传室

　　运用PCR技术对94例原发不育患者的精蛋白2基因(PRM2简称P2) 5′端GA重复区进行了分析, 以比较各等位片段的分布,并在异常组进行突变筛查。

　　材料和方法　94例原发性男性不育患者来自本院男性门诊,年龄25～40岁。经蛋白电泳筛查,分为精蛋白正常组(82例)和精蛋白异常组(12例)。引物：412F AGG GGT AGA GGC TGC TAT GAT, 567R CAG CAG CAA ACA GTT CCC TAA TAG C 。

　　精子核DNA提取: 精液离心去精浆,生理盐水离心洗涤精子三次后,悬于TE液中,加二倍体积4mol/L盐酸胍/2.5mol/L β-巯基乙醇,37℃保温至溶液清澈。加二倍体积－20℃无水乙醇沉淀DNA,仔细混匀,-20℃放置2小时以上。弃去乙醇,用-20℃70％乙醇洗涤沉淀,干燥后,将沉淀浸泡于适量的TE中,加入10％SDS,20g/L蛋白酶K,使其终浓度分别为0.5％和200～400mg/L,充分混匀，置55℃消化24小时，使沉淀完全溶解。用酚、氯仿及异戊醇纯化。干燥后，再溶于适量的TE中,4℃贮存备用。PCR扩增: 反应总体积25μl,含DNA模板 100 ng, 5 pmol引物,60mmol/L Tris-HCl,15mmol/L(NH₄)₂SO₄, 2.5mmol/L MgCl₂, 250μmol/L dNTP, Taq聚合酶 1 U。反应先于97℃变性2分钟,再于80℃加入Taq酶。循环条件：94℃40秒,55℃25秒,72℃40秒,共30～35个周期,最后一个周期于72℃延伸7分钟。PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,将凝胶置于10％乙醇中浸泡5分钟,1％ 硝酸浸泡3分钟,双蒸水洗涤一次,0.2％硝酸银染色20～30分钟,双蒸水洗涤2～3次。最后用3％ 无水碳酸钠/0.019％甲醛显色至条带清晰为止。10％醋酸停影。

　　结　果　在精蛋白正常组共检出七种等位片段：179bp (19.5%),181bp(22.0%),183bp (27.5%),185bp (14.0%),187bp (4.3%),189bp (5.5%)和191bp (7.3%)。杂合度为81.7％,多态信息量PIC为 0.808。在精蛋白异常组共检出五种等位片段：181bp (21.0%), 183bp (66.7%), 185bp (8.3%), 189bp (4.2%)和191bp (4.2%)。杂合度为33.3％, PIC为0.501。扩增片段亦在179～191bp的范围内,无异常扩增片段出现。

　　讨　论　人类精蛋白基因分为P1,P2,TP2。 P2基因5′端转录起始位点上游-506至-478碱基位区域的GA，二核苷酸重复序列为P2基因所特有。该位点包含多重重复的AGAGAGAG序列,为GAGA因子的识别位点。该位点的异常扩增可以通过改变P2基因启动子区域核小体的构象影响P2基因的转录，可能构成影响男性生育的一种机制，故有人称该位点为致育位点,推测在精蛋白异常的不育患者中，该位点可能存在突变。

　　1994年,Krawetz等对两类人群(三个CEPH家系及非相关人群)P2基因5′端GA重复区进行了比较研究，在非相关人群中发现了六种等位片段。

　　本研究结果显示所调查的精蛋白正常人群与已报道的CEPH非相关人群在该位点各等位片段的分布存在明显不同。分布最大峰位置前者在183bp,后者在179bp。此外我们还发现一新的187bp等位片段,似表明存在民族间差异。同时,该位点的高杂合度表明它是一个较好的遗传标记。

　　精蛋白异常组与正常组相比较,该位点各等位片段的分布亦有明显差异。异常组183bp片段频率明显升高，杂合度明显下降,但扩增片段都在正常范围内。Krawetz等曾对8例精蛋白异常的男性不育患者P2基因的该位点进行调查,亦未发现异常。似表明，因GA重复多态区的异常扩增导致P2基因表达异常的可能性不大。精蛋白基因的表达可能是一复杂的多因子调控结果，阐明精蛋白表达与精蛋白基因突变之间的关系，还有待于对该基因更多位点的进一步研究。

(收稿：1997-07-08　修回：1998-09-28)