单精子卵胞浆内穿刺术治疗男性不育症的探讨(附23例报告)

临床泌尿外科杂志 2000年第4期第15卷 临床研究

作者：黄学锋　郑菊芬　周颖　林金菊　赵军招　叶碧绿　李澄棣

单位：温州医学院附属第一医院生殖医学中心，浙江温州，325000

关键词：单精子卵胞浆内穿刺术；男性不育症；妊娠

　　摘要　目的：探讨单精子卵胞浆内穿刺术（ICSI）治疗严重精液异常和梗阻性无精子症所致不育的疗效。方法：对23例严重精液异常和梗阻性无精子症患者施行ICSI，女方行常规超促排卵以获取卵子并选择成熟的卵母细胞，同时采用手淫法、经皮附睾穿刺术（PESA）和睾丸精子获取术（TESE）以获得精液、附睾及睾丸精子行ICSI。结果：23例23个治疗周期共获卵332个，其中300个成熟卵母细胞进行了ICSI，193（64.3%）个卵子正常受精，形成180个胚胎，每个治疗周期移植胚胎2～4个（平均3.07个），8例获得临床妊娠，2例系双胞胎，总周期临床妊娠率为34.8%。其中11例11个治疗周期采用精液精子行ICSI，4例妊娠；12例12个治疗周期采用附睾精子或睾丸精子，4例妊娠。结论：ICSI可以有效地治疗严重的精液异常和梗阻性无精子症所致的不育症。

Intracytoplasmic sperm injection for treatment of severe male infertility (Report of 23 cases)

HUANG Xue-feng　ZHENG Ju-fen　ZHOU Ying　LIN Jin-ju

　　ZHAO Jun-zhao　YE Bi-lu　LI Cheng-di

　　(Reproduction Medicine Unit, Wenzhou Medical College 1st Affiliated Hospital, Wenzhou, Zhejiang，325000)

　　Abstract　Purpose:To investigate the efficacy of ICSI treatment for severe male factor infertility.Methods: The female partners were routinely superovulated and had oocyte retrieval under transvaginal ultrasound. MII oocyte was selected to be microinjected with a single spermatozoon, which was prepared from semen, PESA and TESE samples respectively .Results: Among 332 oocytes retrieved, 300 MII oocytes were microinjected, 193 (64.3%) oocytes were normally fertilized, 180 fertilized oocytes cleaved to embryos. 2～4 (mean 3.07) embryos were replaced into uterus for each transfer. 8 clinical pregnancies (2 twin) were achieved, with a pregnant rate per cycle of 34.8%. 4 pregnancies resulted from 11 ICSI cycles with semen spermatozoa and 4 from 12 cycles with epididymal or testicular spermatozoa. Conclusions: ICSI is an effective method to treat severe male infertility.

　　Key words　Intracytoplasmic sperm injection　Male infertility　Pregnancy

　　自1992年Palermo等^〔1〕采用单精子卵胞浆内穿刺术（ICSI）治疗严重精液异常的男性不育症获得成功以来，ICSI已被广泛用于治疗男性严重不育症。我们于1999年2～8月采用ICSI技术治疗严重精液异常和梗阻性无精子症23例(23对夫妇，每例为1个治疗周期)，其中8例获得临床妊娠，现报告如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料

　　本组不育夫妇23对，女方年龄21～39岁，平均30.1岁；男方年龄25～43岁，平均32.5岁。不育年限2～12年。4例为继发性不育，19例为原发性不育。3例在外院行常规IVF或ICSI治疗失败，其余20例均系首次治疗。11例系严重精液异常；12例系梗阻性无精子症，其中2例为先天性双侧输精管缺如，10例为炎症性附睾梗阻。2例先天性双侧输精管缺如和8例精子密度少于5×10⁹/L的患者行染色体核型检查，均为46，XY。

　　1.2　治疗方法

　　1.2.1　女方超促排卵及处理：治疗前，女方使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）行常规超促排卵^〔2〕，经阴道B超行卵泡抽吸术获得卵子。在ICSI操作之前，将卵丘复合物置于含透明质酸酶16×10⁴ IU/L及含10%母体灭活血清的HTF-Hepes中剥离颗粒细胞。

　　1.2.2　精子获取及处理：精液异常者在禁欲3 d后(取卵当天)手淫获得精液，采用Percoll或微量Percoll的方法收集活动精子。无精子症者首先行经皮附睾精子抽吸术（PESA），如附睾液中未发现精子，则立即行睾丸精子获取术（TESE）。经开放性睾丸活检术获得米粒大小睾丸组织，放入HTF-Hepes(Irvine scientific,9529)中，将睾丸组织在培养皿底部的井字划痕上来回搓动，将睾丸精曲小管磨碎，在含精曲小管组织碎片的培养液中可找到睾丸精子。为改善精子活动力，附睾和睾丸精子可行短期培养。在作ICSI前，精子需用含10%母体灭活血清的HTF-Hepes洗涤3次。

　　1.2.3　ICSI操作：ICSI操作参照Payne^〔3〕介绍的方法进行。采用商品化的ICSI注射针，内外径为5和7 μm。自制ICSI持针，尖端内外径为20和100～120 μm。ICSI操作在配有微分干涉光学系统（DIC）的Zeiss倒置显微镜的温台(37℃)上进行。采用两个粗调操作器和两个液压细调操作器(MN-188和MO-188，Narishige)控制显微持针和注射针的移动。一个显微注射器控制显微持针内的压力吸引固定卵子，而精子的吸取和注射及卵胞浆的抽吸由内充硅油的1 ml一次性注射器控制。

　　按下法制作ICSI操作皿：将5 μl的10% PVP(Irvine scientific,99219)置于Petri皿(Falcon 1006，Beckon dickison)中央，在PVP微滴周围放置8个5 μl的含10%母体灭活血清的HTF-Hepes微滴，尽快用石蜡油(M8410，Sigma)遮盖微滴，以免渗透压改变。

　　在ICSI操作前，将处理后的精子放入1～2个HTF-Hepes微滴，而将卵子放入其他的HTF-Hepes微滴，每次卵子总数少于5个。在精子微滴中选择形态正常的活动精子转移到PVP微滴中，用ICSI注射针在培养皿底部猛烈划破精子的尾部，将制动的精子吸入注射针，尾部先吸入，使精子置于注射针尖端。将含精子的显微注射针和持针放入含卵子的微滴中，MII期的卵子由持针吸引固定，使第一极体位于12或6点的位置。将ICSI注射针穿过透明带刺入卵子胞浆内，回抽部分胞浆后将回抽的胞浆和精子注入卵子，缓慢退出注射针。重复以上过程，对每个MII期卵子行ICSI。

　　1.2.4　穿刺卵培养：将穿刺后的卵子置于含10%母体灭活血清的Earle′s（Sigma，E2888）或HTF培养液（Irvine scientific, 9528）中，在37℃含5%CO₂的湿化空气中培养。16～18 h后观察注射卵子是否正常受精，即是否有2个原核和2个极体。穿刺后40～48 h观察有否卵裂。

　　1.2.5　胚胎转移和妊娠观察：受精后24～32 h,将不超过4个形态学评分的最佳胚胎经阴道植入子宫。2周后检测尿和血HCG，确定是否妊娠，5周后B超观察妊娠囊和搏动胎心数目，以确定是否临床妊娠和多胎妊娠。

　　2　结果

　　在23例23个治疗周期中共获卵332个，其中MII期卵子308个。300个MII期卵子进行了显微注射，27个MII期卵子注射后坏死，卵子损伤率为9.0%；193个卵子正常受精，总受精率为64.3%，形成180个胚胎，卵裂率为93.3%。所有治疗周期均有胚胎移植，移植数2～4个（平均3.07个），其中8例获得临床妊娠，2例系双胞胎，均在继续妊娠中。总周期临床妊娠率为34.8%，胚胎种植率为14.1%。

　　在23例23个治疗周期中，11例11个治疗周期采用精液精子行ICSI，4例妊娠，其精液指标和治疗结果见表1。对12例梗阻性无精子症患者，5例5个治疗周期采用经PESA获得的附睾精子，7例7个治疗周期采用经TESE获得的睾丸精子，共获得4例妊娠。采用精液、附睾和睾丸精子的受精率分别为60.8%、63.2%和69.9%，临床妊娠率分别为36.4%（4/11）、60.0%（3/5）和14.3%（1/7）。

表1　异常精液指标和治疗结果

　　¹⁾ 在低倍视野下偶见活动精子，未评价活动率和畸形率

　　²⁾ 双胎妊娠

　　3　讨论

　　严重的精液异常和无精子症患者缺乏有效的男性学治疗方法。体外受精-胚胎转移结合透明带穿孔（PZD）和透明带下精子注射（SUZI）曾被用来治疗严重的精液异常和无精子症，但受精率和妊娠率较低。ICSI的出现给这些难治的不育症患者提供了目前最有效的治疗方法，每周期临床妊娠率达25%～52%^〔4〕。

　　ICSI治疗成功的关键之一是获得较高的卵子受精率，而有经验的操作者往往可获得50%～80%的受精率^〔4〕。正常受精失败主要是由于卵子机械损伤、精子未注入卵子、卵子不能被激活、激活后原核不能形成和不能形成第二极体所致^〔5〕。获得高质量的卵子和熟练的ICSI操作是减少卵子损伤的关键。文献报道卵子损伤率一般为7%～14%^〔4〕，本组卵子损伤率为9%，与之相符。

　　精卵融合后的卵子激活是自然受精过程的关键，将促使卵子完成核的成熟、合成蛋白质和DNA。由于缺乏自然的精卵融合而直接将精子注入卵子胞浆内，一些促使卵子激活的ICSI操作技术成了获得较高的卵子受精率的关键。研究表明，将精子尾部猛烈划破制动精子，有助于精子注入卵子后释放卵子激活因子，激活卵子和促进原核形成^〔6〕。卵子胞浆的钙内流和波动在卵子激活中起着重要作用，而在注入精子前回抽卵胞浆可以获得更高幅度的钙波动而激活卵子，并可确定精子已注入卵胞浆，将受精率从38%提高到80%^〔7〕。我们采用了这些关键操作技术，在23例23个治疗周期中获得了平均64.3%的正常受精率。

　　只要获得活的精子就可行ICSI治疗。据文献报道，ICSI的受精率和妊娠率不受精液指标的影响，即使精液中偶见精子，也可以行ICSI治疗^〔8〕。而对梗阻性无精子症，只要在睾丸或附睾中获得活的精子，进行ICSI可以获得同样的受精率和妊娠率^〔9〕。本组采用精液精子、附睾精子和睾丸精子行ICSI获得相似的受精率，但临床妊娠率却有较大差异。虽然本组例数较少，尚不能明确不同来源精子对ICSI治疗结果的影响，但本组获得妊娠的病例包括了不同程度的严重精液异常和梗阻性无精子症，表明ICSI可以有效地治疗严重的精液异常和无精子症所致的不育症。

　　【编者按】　据文献报道，约40%的不育男子精子生成异常，但找不到特殊原因。一般认为主要存在两个原因，第一个原因是10%～20%患者的某一个染色体中存在无精症缺失基因(DAZ)；第二个原因是存在肺囊泡纤维症跨膜介导的调节基因(CFTRG)，其变化可导致先天性双侧输精管缺如。这两个原因向人们提出了一个重要问题，在施行ICSI前必须作FISH，以筛选出性染色体异常。并强调，对不育男子应做一些基本检查，临床医生必须牢记在进行ICSI时应对女方进行一些检查和治疗，况且ICSI还不是一种绝对安全的治疗方法。

　　参考文献

　　［1］Palermo G D,Joris H,Devroey P,et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single sperma-tozoon into an oocyte.Lancet,1992,340:17～19

　　［2］庄广伦，顾正田，周灿权. Buserelin在超排卵周期中的作用和对卵泡液的影响.中华妇产科杂志，1993，28：10～12

　　［3］Payne D.Intracytoplasmic sperm injection:instrume-ntation and injection technique.Reprod Fertil Dev,1995,7:185～196

　　［4］Schlegel P N,Girardi S.In vitro fertilization for male factor infertility.J Clin Endocrinol and Metab,1997,82:709～716

　　［5］Flaherty S,Payne D,Swann N J,et al.Aetiology of failed and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection (ICSI).Hum Reprod,1995,10:2623～2629

　　［6］Palermo G D,Schlegel P N,Colomdero L T,et al.Aggressive sperm immoblization prior to intracytoplasmic injection with immature spermatozoa improves fertilization and pregnant rate.Hum Reprod,1996,11:1023～1029

　　［7］Tesarik J,Sousa M.Key elements of highly efficient intracytoplasmic sperm injection technique:Ca²⁺ fluxes and oocyte cytoplasmic dislocation.Fertil Steril,1995,64:770～776

　　［8］Nagy Z P,Liu J,Joris H,et al.The result of intracy-toplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters.Hum Reprod,1995,10:1123～1129

　　［9］Tarlatzis B C,Bili H.Survey on intracytoplasmic sperm injection:report from ESHRE ICSI task force.Euro-pean society of human reproduction and embryology.Hum Reprod,1998,13(Suppl 1):165～177

收稿 1999-10-25