雄激素致不孕大鼠肥胖-无排卵机制及滋肾阴药作用的探讨

中华内分泌代谢杂志 1999年第5期第15卷 论著

作者：孙斐　俞瑾　笪翠娣　黄娅林

单位：孙斐、俞瑾　200011 上海医科大学妇产科医院；笪翠娣、黄娅林　上海医科大学医学神经生物学国家重点实验室

　　关键词： 雄激素；大鼠；雌激素受体；神经肽Y；瘦素；中药

　　【摘要】　目的　探讨9日龄雄激素致不孕大鼠(9d-ASR)肥胖-无排卵机制及滋肾阴药的作用。方法　给出生9日龄SD雌性大鼠一次性皮下注射丙酸睾丸酮，建立9d-ASR模型。检测雌激素受体(ER)和神经肽Y(NPY)神经元共存情况；检测9d-ASR下丘脑ER、NPY及促性腺激素释放激素(GnRH)含量变化；测定血雌二醇(E₂)、睾酮(T)、瘦素、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)的变化。结果　ASR呈能量失衡致肥胖状态，血E₂、T、瘦素水平明显增加(P＜0.01)，FSH、LH明显低下(P＜0.01)，下丘脑ER存在于NPY神经元上，其数目减少，NPY表达增强，GnRH分泌下降。NPY与ER或GnRH均呈负相关(r=-0.7104,P＜0.01；r=-0.8802,P＜0.01)。瘦素与体重呈正相关(r=0.8977,P＜0.01)，与FSH、LH呈负相关(r=-0.7517,P＜0.01；r=-0.8444，P＜0.01)。用滋肾阴药治疗后，各神经内分泌-代谢指标均恢复正常。结论　9d-ASR模型有神经内分泌-代谢失调而致肥胖并引起低促性腺激素性性腺功能低下性无排卵，滋肾阴中药有纠正这些失调而产生减肥及促排卵的作用。

Mechanism of obesity-anovulation in androgen-sterilized rat and the weight reducing and ovulation inducing effects of tonifying Kidney yin herbs

SUN Fei,YU Jin,DA Cuidi,et al

　　.Obstetric and Gynecologic Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai,200011

　　【Abstract】　Objective　To explore the mechanism of obesity and chronic anovulation in androgen-sterilized rat at age of 9 days (9d-ASR) and the effect of herbs of tonifying Kidney yin.Methods　9d-ASR model was established by injecting testosterone propionate subcutaneously to SD female rat at age of 9 days. Double immunofluorescent staining was carried out on sections through arcuate nucleus (ARC) to determine whether neuropeptide Y (NPY)-containing neurons expressed estrogen receptors (ER). The immunoreactive amounts of ER, NPY neurons and gonadotropin-releasing hormone (GnRH) fibers of hypothalamic ARC-median eminence (ME) in 9d-ASR were studied with immunohistochemistry. Serum estrogen (E₂), testosterone (T), leptin, follicular stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) were measured with radioimmunoassay. All parameters were reevaluated after administration of herbs to 9d-ASR.Results Estrogen receptors were predominantly distributed in the cytoplasm of NPY-containing neurons as well as in the nucleus and axons of NPY-synthesizing neurons. Compared with normal group, ASRs were characterized by high metabolism rate, obesity, increase in hypothalamic NPY expression (P＜0.01), decrease in numbers of ER and GnRH secretion (P＜0.01). Levels of serum E₂, T and leptin were significantly higher and FSH and LH levels significantly lower in 9d-ASR than in normal rats (P＜0.01). Significantly negative correlation between NPY and ER or GnRH (r=0.7104, P＜0.01; r=-0.8802, P＜0.01, respectively) were observed, and so were the correlations between leptin and FSH or LH (r=-0.7517, P＜0.01; r=-0.8444, P＜0.01, respectively). Serum leptin showed positive correlation with body weight in 9d-ASR (r=0.8977, P＜0.01). These dramatic neuroendocrine-metabolic changes became normal after feeding 9d-ASR with herbs.Conclusions　Obesity and chronic anovulation coexist in 9d-ASR. Elevated E₂ levels may down-regulate the hypothalamic ER oriented NPY neurons, followed by the release of NPY and suppression of GnRH. Effect of the herbs may be involved in reducing body weight and inducing ovulation.

　　【Key words】　Androgen Rat Estrogen receptor Neuropeptide Y Leptin Traditional Chinese herbs

(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:259-262)

　　机体的生殖能力与其营养及代谢状况有关^〔1〕，能量摄入与消耗处于不平衡状态时能影响生殖功能，如肥胖不仅在一定情况下影响排卵功能，而且也是发生糖尿病和心血管疾病的重要危险因素。遗传性肥胖小鼠模型(ob/ob鼠)表现为肥胖、中枢性卵巢功能低下、不育、高胰岛素血症和胰岛素抵抗、下丘脑神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)分泌明显增加等现象^〔2〕，最近已发现这些现象和肥胖基因编码的产物瘦素(leptin)原发性缺乏有关^〔3〕，NPY刺激进食。NPY神经元与下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)神经元有突触联系，NPY能刺激GnRH-促黄体激素(LH)的分泌，但具有性激素尤其是雌激素依赖性^〔4〕。俞瑾等^〔5〕采用9日龄SD雌性大鼠成功地诱发出高雄激素高胰岛素无排卵动物模型——雄激素致不孕大鼠(androgen-sterilized rat, ASR)，发现ASR具有许多类似ob/ob小鼠的症状，如高胰岛素高雄激素血症、胰岛素抵抗、卵巢呈多囊性变、无排卵、不育、性腺功能低下^〔6-8〕，并发现补肾中药可逆转这些现象。张月萍等^〔6〕于1993年注意到9日龄ASR(9d-ASR)尚有肥胖的特点。本实验研究9d-ASR模型中雌激素受体(ER)与NPY及GnRH的关系及瘦素的作用，以及灌服滋肾阴药后这些指标的变化，以探讨9d-ASR肥胖及与不育的关系及中药的减肥-促排卵效果和中枢作用的环节。

　　材料和方法

　　一、9d-ASR模型建立及给药方法^〔5〕

　　9日龄SD雌性大鼠分3组：正常对照组(C组，15只)；9d-ASR组(A组，15只)；9d-ASR给滋肾阴药组(A+H组，15只)。A组及A+H组颈　背部皮下一次性注射　丙酸睾丸酮1.25mg，C组注射同等量中性茶油。21日龄断乳，25℃恒温(50%湿度)清洁级饲养，不加饲维生素类制品。12小时光照(6:00～18:00)和12小时黑暗周期交替进行。饲料和水充足供给。70日龄起做连续阴道涂片共11天，阴道上皮细胞持续角化，无周期性，无排卵，作为9d-ASR模型。81日龄起，A+H组灌服滋肾阴药“天癸方”(全国名老中医俞瑾验方：生地12g、仙灵脾12g、补骨脂12g、女贞子12g、菟丝子12g、萸肉12g、淮山药12g、茯苓9g、知母12g。上海医科大学药学院生药教研室提取水溶性部分，制成浸膏342mg/ml，每ml含生药3g，按临床剂量20倍给药，每100g体重给药约1ml)，连续21天。A组及C组同法灌服等量蒸馏水。

　　二、取材

　　70～100日龄每天记录进食量。101日龄称体重，大鼠不禁食，于动情期用戊巴比妥钠(50　　mg/kg,i.p.)麻醉，心室灌注，取脑后固定。根据Koning等^〔9〕大鼠脑定位图谱，从A5150～A3180〔弓状核(ARC)-正中隆起(ME)所在的平面〕用冰冻切片机将组织切成30μm厚的切片，进行免疫组化处理。取腔静脉血，离心后取血清置-20℃待放射免疫测定(RIA)。分离腹膜后脂肪垫(retroperitoneal fat pad, RPFP)并精确称重。

　　三、实验室检测

　　1.RIA测定：雌二醇(E₂)、睾酮(T)、大鼠瘦素RIA药盒分别购自DPC和美国LINCO Research INC，批间及批内变异均＜8%。特异性大鼠促卵泡激素(rFSH)及大鼠促黄体激素(rLH)RIA药盒由美国National Institute of Diabetes、Digestive & Kidney (NIDDK)和美国National Hormone & Pituitary Program的Parlow博士惠赠，批间及批内变异分别＜10%及＜7%。

　　2.免疫组织化学检测：分别取各组ARC-ME头、中、尾三部分切片进行免疫组化检测。兔抗鼠ER_α(1:400)及兔抗NPY(1:8000)分别购自Santa Cruz公司及Sigma公司；兔抗GnRH(1:1000)由中科院动物所生殖生物学国家重点实验室庄临之教授惠赠。采用ABC法(药盒购自Santa Cruz公司)。用正常兔血清代替一抗作为阴性对照。免疫阳性物质的相对含量在Alpha Imager^TM2000 Digital Imaging & Analysis Systems (Alpha Innotech公司)上用OptiGreen软件测定其密度(spot densitometry)，以校正背景后区域像素点(pixel)密度平均值表示。

　　3.ER和NPY双标荧光免疫组化检测：鼠ER单抗IgG₁购自Santa Cruz公司(1:250)，罗达明(TRITC)标记羊抗鼠IgG(1:20)购自Boehringer Mannheim公司；兔抗NPY(1:4000)购自Sigma公司，荧光素(FITC)标记猪抗兔IgG(1:40)为DAKO公司产品。一抗混合物(同时含ER抗体、NPY抗体)孵育37℃1小时，而后4℃48小时，用正常羊、猪血清混合物代替一抗混合物作为阴性对照。荧光二抗混合物孵育37℃1小时，磷酸甘油封片。结果用Leica TCS-NT激光共聚焦显微镜(CLSM)分别于x、y、z轴作0.1μm厚度的FITC和TRITC双通道荧光断层扫描并作三维重建，观察ER和NPY神经元共存情况。

　　四、统计方法

　　用SAS 6.12统计软件包对数据进行ANOVA分析，分别采用Dunnett T-test和Student-Newman-Keuls进行检验。相关检验采用Pearson相关分析。以体重作为协变量，瘦素和NPY关系采用协方差分析和Partial相关分析。

　　 结　果

　　一、9d-ASR肥胖现象

　　9d-ASR　组摄食量比正常组明显增　加(P＜0.01)，腹膜后脂肪沉积增多，体重明显上升(P＜0.01)，同时表现为持续不排卵和卵巢黄体减少。给予补肾中药“天癸方”后，其摄食量、体内脂肪贮积明显下降，体重恢复正常(P＜0.01)，阴道细胞呈周期性变化，排卵功能恢复(表1)。

　　二、9d-ASR组实验室指标的变化

　　ER在下丘脑内侧基底核平面除分布于ARC外，腹内侧核及ME也有ER存在。和正常对照组相比，　　9d-ASR大鼠ER明显减少(P＜0.01)，而外周E₂水平明显升高(P＜0.01)。T、log(T/E₂)亦增高。NPY胞体和纤维主要分布在ARC和ME环第三脑室处，9d-ASR中NPY免疫活性明显高于正常组(P＜0.01)。在弓状核平面GnRH纤维主要分布在ME内带，室周核处也有较多GnRH纤维和少量GnRH阳性细胞，ARC中未见GnRH阳性细胞。图像处理结果显示正常大鼠ME GnRH含量明显高于9d-ASR组，9d-ASR ME仅见少量GnRH纤维分布。双标荧光免疫组化表明：NPY神经元胞核和胞浆及轴突纤维均有ER分布(图1)。9d-ASR垂体功能呈低促性腺激素性，FSH、LH分泌呈低值状态。外周卵巢雌激素分泌异常，脂肪组织分泌的瘦素水平明显高于正常组(P＜0.01)(表2)。

表1　三组大鼠体重、RPFP、摄食量比较(x±s)

　　Tab 1　Body weight, RPFP and food intake in three groups of rats (x±s)

　　注：()为单因素方差分析的P值　Data in parentheses denote the P value of one-way ANOVA；与C组比较　Compared with group C,^*P＜0.01；RPFP：腹膜后脂肪垫　Retroperitoneal fat pad

(弓状核，双荧光免疫染色　ARC,double immunofluorescence staining,×20)

(视前区，双荧光免疫染色　Preoptic area,double immuinofliorescence staining,×100)

1　弓状核和视前区部位EP和NPY神经元胞体和纤维共存情况

　　Fig1 ER and NPY-immunoreactive neurons and fibers in ARC and preoptic area

表2　三组下丘脑-垂体-卵巢-脂肪组织各水平相应指标免疫阳性(IR⁺)平均密度或血清水平(x±s)

　　Tab 2　　The average immunoreactive (IR⁺) spot densities or serum levels in hypothalamic-pituitary-ovary-fat tissue axis in three groups of rats (x±s)

　　注：rARC,mARC,cARC：ARC头、中、尾部分　Rostral, medial, caudal part of arcuate nucleus；　　与C组相比　Compared with group C,^*P＜0.01　　三、肥胖与生殖功能的关系

　　协方差分析结果显示，体重与瘦素、NPY均呈正相关(r=0.8977,P＜0.01；r=0.8567,P＜0.01)，排除体重干扰后，血瘦素和NPY间无相关性(F=1.67,P＞0.05)。从上述资料作相关分析，血E₂与T之间呈正相关(r=0.6494,P＜0.05)，血瘦素与FSH、LH之间呈负相关(r=-0.7517,P＜0.01；r=-0.8444,P＜0.01)。NPY与ER、GnRH间　呈负相关　(r=-0.7104,P＜0.01；r=-0.8802,P＜0.01)。

　　讨　论

　　一、9d-ASR肥胖-无排卵机制

　　本研究发现9d-ASR较正常大鼠有高代谢、能量不平衡致肥胖、高雌激素、下丘脑ER数目减少、NPY表达增强、GnRH、FSH或LH分泌下降、无排卵、瘦素升高的现象。NPY是含36个氨基酸的肽，广泛分布于中枢和外周神经系统，调节摄食行为和能量平衡，是目前所知的最强效的食物摄入诱导剂之一，其活性过度表达可导致肥胖的发生^〔2〕。本文9d-ASR体重与下丘脑NPY呈明显正相关，提示9d-ASR肥胖可能与NPY活性的超表达有关。NPY除了调节代谢作用外，对生殖亦有调节作用。正常性激素环境下，下丘脑NPY促进GnRH分泌；低雌激素时，NPY抑制GnRH分泌^〔10〕。本实验9d-ASR在外周高雌激素环境下，E₂可通过降调NPY上ER引起NPY表达增强，进而抑制GnRH分泌和FSH或LH释放，导致低促性腺激素性性腺功能低下、无排卵。9d-ASR中，T、log(T/E₂)明显增高，T与E₂有正相关关系，提示E₂增高可能由于其前体合成原料T的体内芳香化作用增强所致。NPY可能作为连接能量代谢和生殖功能的“桥梁”。雌激素起着“开”或“闭”闸门式作用。

　　瘦素作为一种脂肪贮积的分子信号调节摄食行为(降低食欲)、代谢和能量平衡(增加能量消耗)，对控制体内脂肪积聚有重要作用^〔3〕。同时瘦素与生殖功能亦有密切联系，它能逆转ob/ob小鼠不育现象^〔9〕，能启动并提早正常雌性小鼠青春期出现^〔11〕。瘦素与NPY作用相反，形成一对共轭子，共同“监控”着机体的代谢和生殖。本文肥胖大鼠瘦素明显增高，协方差分析排除体重干扰后，血瘦素和NPY间无相关性，说明可能存在着外周或中枢瘦素拮抗现象，外周瘦素可能不直接影响中枢NPY的分泌。但9d-ASR血瘦素与垂体FSH或LH有明显的负相关关系，提示异常水平的瘦素可能直接作用于垂体抑制FSH或LH的分泌。这与Yu等^〔12〕在体外研究不同浓度的瘦素对大鼠FSH或LH释放实验中观察到低浓度或生理剂量瘦素可促进LH分泌，而高浓度则抑制其分泌的现象相一致。瘦素可能作为一种能量代谢失衡的信号“通知”中枢神经系统对生殖功能进行调节。

　　二、滋肾阴药“天癸方”对9d-ASR病理状态的调整作用

　　全国名老中医俞瑾根据中医“肾主生殖”理论并结合多年临床经验，研制成“天癸方”已在临床多囊卵巢综合征高雄激素高胰岛素出现者和9d-ASR动物模型中取得良好的促排卵效果，促排卵率达60%^{〔8，13，14〕}。同时也注意到该方有减肥效应^〔6，14〕。本文对9d-ASR灌服该方后，其体重下降、脂肪贮积指标瘦素下降、NPY下降、GnRH-LH或FSH分泌正常、生殖功能恢复、排卵出现。说明“天癸方”可能在中枢(下丘脑-垂体)和外周(脂肪组织、卵巢)各水平协调发挥作用，调整能量失衡(瘦素/NPY变化)和生殖低下(低GnRH-FSH或LH分泌、异常性激素环境)；同时也说明肥胖与不育在某种程度上紧密相关，补肾中药对9d-ASR治疗可同时调节中枢及外周(代谢-生殖轴)功能，为肥胖及肥胖性不育的治疗提供科学依据。

　　*本课题受“上海市医学领先专业重点学科中西医结合妇科”基金赞助(No.96001)

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收稿：1999-02-09　修回：1999-08-15