关于核酶治疗病毒性肝炎的研究

　　生物体内除了蛋白酶外，还有一种具有催化功能的核糖核酸分子——核酶。核酶的发现 最早可起源于对四膜虫以及一些植物病毒、类病毒等的观察。它们的核酸分子都具有自我剪 接的功能。这些自我剪接反应都是可逆的，具有酶催化反应的性质。以后根据这些天然核酶 的结构，人工合成了可以序列特异性地切割靶RNA的核酶，抑制基因表达，特别是抑制某些 有害基因的表达。

　　核酶的发现及其研究不仅具有理论上的指导意义，而且也具有重要的实用意义。通过对核酶 进行人工设计和改造，人们不仅可以获得自然界罕见的RNA限制性内切酶，用于生物学研究 ，而且，由于核酶可以序列特异性地切割靶RNA，抑制基因表达，特别是使抑制有害基因的 表达成为可能。结合一些基因的治疗手段，对遗传病、癌症和病毒性疾病，尤其对我国人民 危害极大的病毒性肝炎开展基因治疗，具有十分诱人的应用前景。

　　乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链的DNA病毒。其复制过程中有一个从前基因组RNA到DNA的逆转 录过 程。如果以这段3.6 kb的前基因组RNA为靶子，设计核酶对其进行降解就可以打断它的生活周期。

　　早在1992年Von Weizsaecker等就开展了这方面的工作。他们针对HBV前基因组RNA的一些关 键部位设计了3个锤头型核酶，与体外转录的全长RNA放在50 ℃温育，丙烯胺凝胶电泳显示 RNA被切割成不同长短的片段，与预期的长度相符。为了排除非特异性切割或RNA酶的降解作 用，他们还把冷的RNA与核酶放在一起，此时就不会出现以上的片段。Weizsaecker还发现3 个核酶同时切割的效果明显大于单个核酶的效果，这可以用来对抗病毒的变异。

　　Jugen Beck所设计的核酶针对HBV前基因组RNA的包装信号，它是一个高度保守的、茎环结构 的顺式因子，在基因组中出现了2次，它对病毒的包装及反转录都起着很重要的作用。根据 这些特点，它被认为是比较理想的靶子。

　　中国科学院上海生物化学研究所郑文超等针对HBsAg，HBcAg,HBeAg设计了5种锤头型核酶， 不仅在细胞外，而且首次在细胞内观察到了其对HBV的抑制，各抗原及病毒颗粒都明显减少 。他们设计的核酶构建了带有5′，3′自身修剪的真核细胞核酶表达质粒，包 括含单个核 酶基因的和多个串联的鸟枪型核酶基因的质粒，通过转染把它们同带有HBV基因组的质粒p1. 2II转入HepG2细胞。用Southern-blotting,ELISA,Rnase保护法等测定结果后，显示：HBsA g,HBcAg,HBeAg以及它们相应的RNA、Dane颗粒数都因为核酶的作用而明显地减少。

　　Putlitz等学者用重组筛选的方法从一个发夹型核酶库中(5×105个)确定能有效地在转基 因人肝癌细胞(HCC)中切割HBV前基因组RNA的核酶。这个核酶库包含了任意序列的底物结合 位点。通过实验发现RNA上有40个部位可以和核酶结合，其中17个在HBV所有4个亚型中都存 在。然后他们根据这17个保守位点设计了4个发夹型核酶，与一个有复制活性的HBV DNA二 聚体同时转入HCC细胞系中。结果核酶对HBV的抑制分别达到80%、69%、66%和49%。

　　丙型肝炎病毒(HCV)是一种RNA病毒。用目前的抗病毒手段非常容易诱导变异从而产生耐药性 。We lch等针对HCV正链与负链RNA高度保守的区域设计了多个核酶。在体外比较了它们对RNA的切 割活性。挑选了其中几个最有效的核酶，连接入腺相关病毒(AAV)载体和腺病毒载体。发现 它们在组织培养中对HCV病毒有非常明显的抑制作用。这一结果为将来研制抗HCV药物带来了 希望。Welch还设想可以将这种核酶插入嗜肝病毒载体静脉注射入人体，使其在人体肝细胞 中不断地释放出来。降解HCV正链甚至负链。本期报道的两篇有关核酶抗HCV的作用也是一个 可喜的尝试。

　　目前，核酶在体内应用研究已取得了很大的进展，但多数研究仍处于实验阶段，要使核酶真 正用于人类疾病的防治，仍有一段很长的路要走。包括核酶如何导入细胞与表达；核酶引入 细胞后的稳定性；核酶结构的设计，特别关键的是选择合适长度的侧翼；底物的选择以及如 何提高核酶的活力等方面均有待于进一步探索和解决。

作者单位：邬祥惠（200040　上海医科大学华山医院）

翁心华（200040　上海医科大学华山医院）

李缨（200040　上海医科大学华山医院）

　　参考文献

　　1，Beck J, Michael N. Efficient hammerhead ribozyme-mediated cleav age of the structured HBV en-capsidation signal in vitro & in cell extracts, bu t not in intact cells. Nucl Aci Res, 1995,23:4954-4962.

　　2，Zu Putlitz J, Yu Q, Burke JM, et al. Combinatorial screening method has been used to identify hairpin ribozymes that inhibit hepatitis B virus (HBV) replicat ion in transfected human hepatocellular carcinoma cell. J Virol, 1999,73:5381-5 387.

　　3，Welch PJ, Tritz R, Yei S, et al. Intracellular application of hairpin ribozym e genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997,4:736-743.

　　4，Welch PJ, Yei S, Barber JR. Ribozyme gene therapy for hepatitis C infection. Clin Diagn Virol, 1998,10:163-171.

摘自《中华传染病杂志》