幽门螺杆菌液体培养新法的研究
中华医学检验杂志 1999年第6期第22卷 论著摘要
作者：吴超 张卫军 郭刚 邹全明
单位：400038 重庆，第三军医大学临床微生物教研室
幽门螺杆菌(Hp)的液体培养方法甚多，而这些方法都存在着培养量受限、操作不方便等诸多不利因素。我们采用抽滤瓶作为培养容器建立了一种新型实用的幽门螺杆菌液体培养方法。
一、材料
1.菌株：从本校附属医院胃病患者的胃粘膜中分离并经鉴定的Hp共5株，编号分别为：H9802、H9803、H9804、H9809、H9810。
2.Hp脑心浸液液体培养基：按照常规方法配制。分装于250 ml规格抽滤瓶各50 ml，密封，高压蒸汽灭菌后备用。
3.气体过滤器：聚四氟乙烯膜。
二、方法
1.接种与培养：在脑心浸液液体培养基中，先加入10%胎牛血清（FCS）、磺胺增效剂（TMP）5 mg/L、多粘菌素B2 500 U/L、万古霉素10 mg/L、葡萄糖5 g/L。然后用6 ml液体培养基洗脱平板上Hp菌（培养48小时），接种于抽滤瓶培养基中，通过气体过滤器连接滤瓶侧口和真空泵进行抽气换气，使气体达到微需氧条件（5%O2、85%N2、10%CO2），置于恒温振荡器中37℃振荡培养。
2.5种Hp菌株在脑心浸液液体培养基中的生长：分别接种此5株Hp菌悬液［浓度为108～109菌落形成单位(CFU)/L)］各5 ml于抽滤瓶的脑心浸液液体培养基中，微需氧条件下37℃振荡培养3天，每12小时测定其菌量。选择生长能力最强的菌株进行以下的试验。
3.不同接种量对Hp生长的影响：分别接种106、107、108、109 CFU/L4种浓度的Hp优选菌株菌悬液各5ml于脑心浸液液体培养基中，微需氧条件下37℃振荡培养3天，每12小时测定其菌量。
4.培养过程中换气对Hp生长的影响：接种同等浓度的菌悬液各5 ml于2瓶30 ml脑心浸液液体培养基中，微需氧条件下37℃振荡培养3天，其中1瓶每天换气1次，另1瓶在培养过程中不换气，每12小时测定其吸光度值(A)。
5.Hp的定量检测：(1)平板菌落计数法：取1 ml培养物用新鲜培养基进行10倍倍比稀释，分别从各稀释管中取50 μl，用L形棒涂布接种于脑心浸液琼脂培养基上（含5%脱纤维绵羊血），微需氧条件下37℃培养72小时后进行菌落计数，然后换算为CFU/L。(2)A值测定法：以同种培养条件下未加Hp的脑心浸液液体培养基作为空白对照，在分光光度计上600 nm波长下测定其A值。
三、结果
1.Hp菌株在脑心浸液液体培养基中的生长：5株Hp均生长良好，其生长速度各不相同。其中H9809株生长速度最快，在培养24小时后便达最大菌量1.6×1011CFU/L。5株Hp培养24～48小时后其菌量均达1011CFU/L。选择生长活力最高的H9809株进行后面的试验。
2.不同接种量对Hp生长的影响：4种浓度的Hp菌悬液接种于脑心浸液液体培养基中，用于进行Hp生长的动力学研究。不同的接种浓度有着不同的对数生长期。当接种浓度为108CFU/L和109CFU/L时，最大菌量分别于24小时和36小时后达到，随着接种浓度的降低，最大菌量所需时间相应推迟。当接种浓度为106CFU/L和107CFU/L时，在培养48小时后才达到最大菌量。
3.培养过程中换气对Hp生长的影响：Hp液体培养过程中的气体条件是直接影响Hp生长速度的重要因素。培养过程中换气可使Hp达到最大生长量所需的时间，较不换气培养提前12个小时，且前者所达到的最大菌量较后者高。
四、讨论
Hp是一种营养要求很高的细菌，在一般的培养条件下不能生长。目前，针对Hp的固体培养方法已经较成熟，但是，液体培养尤其是用于大规模培养的方法仍存在许多问题。我们采用滤瓶培养法克服了锥形瓶培养法和组织培养瓶法的培养量受限，操作繁琐等缺点［1］，它可以通过气体过滤器从滤瓶侧口进行抽气换气，不仅避免了气体中的污染，而且不需外部气体容器，可直接进行振荡培养。同时，不同规格的滤瓶满足了不同试验的要求。滤瓶培养使Hp在脑心浸液液体培养基中能良好生长，培养24～48小时后便达1011CFU/L的最大菌量，细菌生长周期短，更宜于大规模培养。
在Hp生长动力学研究中，我们发现最初的接种量是影响Hp生长的重要因素。不同的接种量决定着Hp的不同生长速度，接种量越大，最大生长量所需的时间越短。本方法的最适接种量为108～109CFU/L，因为其最大生长量所需的时间最短。如果试验要求培养时间较长，可适当减少接种量。Hp生长过程中的换气也十分重要。Hp生长需不断消耗O2和CO2，使微需氧条件发生改变，可直接影响Hp生长速度和最大生长量［2］。简便的换气操作使滤瓶培养法更具优势，随时快捷的换气，使Hp生长的气体条件得到改善，进而促进Hp生长。
本课题受国家重点科技攻关计划课题基金资助(编号：969010154)
参考文献
[1] Secker DA, Tompkins DS, Alderson G. Gas-permeable lifecell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in liquid medium. J Clin Microbiol,1991,29:1060-1061.
[2] Xia HX, English L, Keane CT, et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid medium. J Clin Pathel, 1993,46:750-753.
(收稿：1998-12-25 修回：1999-07-10)
诙蹋擞诖蠊婺Ｅ嘌?/p>
在Hp生长动力学研究中，我们发现最初的接种量是影响Hp生长的重要因素。不同的接种量决定着Hp的不同生长速度，接种量越大，最大生长量所需的时间越短。本方法的最适接种量为108～109CFU/L，因为其最大生长量所需的时间最短。如果试验要求培养时间较长，可适当减少接种量。Hp生长过程中的换气也十分重要。Hp生长需不断消耗O2和CO2，使微需氧条件发生改变，可直接影响Hp生长速度和最大生长量［2］。简便的换气操作使滤瓶培养法更具优势，随时快捷的换气，使Hp生长的气体条件得到改善，进而促进Hp生长。
本课题受国家重点科技攻关计划课题基金资助(编号：969010154)
参考文献
[1] Secker DA, Tompkins DS, Alderson G. Gas-permeable lifecell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in liquid medium. J Clin Microbiol,1991,29:1060-1061.
[2] Xia HX, English L, Keane CT, et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid medium. J Clin Pathel, 1993,46:750-753.
(收稿：1998-12-25 修回：1999-07-10)
用户登录 
新用户注册