自杀基因治疗胃肠道肿瘤的研究进展

中国普外基础与临床杂志 1999年第3期第0卷 临床经验交流

作者：余文林　综述　黄宗海　审校

单位：第一军医大学珠江医院普外科(广州　 510282)

　　随着分子生物学及相关学科的进展，肿瘤的基因疗法倍受关注，其中自杀基因疗法显示了较好的应用前景，该疗法又称药物敏感基因疗法、分子化疗或病毒介导的酶解前药疗法(VDEPT)。其原理是将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因(也叫自杀基因)导入肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可将原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞自杀，而正常组织可免受化疗损伤。现就近5年来自杀基因治疗胃肠道癌肿的进展综述如下。

　　1　自杀基因体系

　　目前已发现和克隆的自杀基因有多种，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-TK)基因、水痘带状泡疹病毒胸苷激酶(varicella-zoster virus-thymidine kinase, VZV-TK)基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Escherichia Coli cytosine deaminase, EC-CD)基因、大肠杆菌脱氧胸苷激酶(deoxycitidine kinase, DCK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(glunaine phosphoribosyl transferase, GPT)基因及细胞色素p450基因。其中研究最深入且应用最广泛的是TK基因及CD基因(见附表)。

附表　常见自杀基因种类及作用机理

　　TK基因编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物(NA)代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用。病毒、细菌及哺乳动物细胞中均含有TK基因，但不同来源的TK基因结构及其蛋白产物理化性质和生物功能均有明显差异。在肿瘤治疗中以HSV-TK及VZV-TK最为常用，HSV-TK编码区共1 128个核苷酸，编码376个氨基酸。

　　CD基因编码胞嘧啶脱氨酶，可将胞嘧啶代谢为尿嘧啶，亦可将5-Fc代谢为5-氟尿嘧啶(5-Fu)。CD基因存在于一些细菌和真菌基因组中，哺乳动物细胞无此基因。目前研究最多的是大肠杆菌CD基因，编码区共1 280个核苷酸，编码427个氨基酸^〔1〕。

　　用于HSV-TK基因疗法的前药有两类，一是嘌呤核苷类似物，包括ACV及其衍生物GCV、潘洛昔非(PCV)、布洛昔非(BCV)，其中GCV对转基因瘤细胞的抑制作用比ACV强10倍，故成为目前肿瘤TK基因治疗中最常用的前药。另一类是嘧啶核苷类似物，主要是BVDU。研究表明，BVDU对哺乳动物细胞无毒性，而其代谢产物可通过两个环节(见附表)引起DNA合成受阻，导致细胞死亡，TK/BVDU体系抗瘤效果比TK/GCV强100倍，有可能成为肿瘤TK基因治疗更合适的前药。

　　2　载体构建

　　载体技术是基因转导和表达的关键，是基因治疗的重点，载体包括病毒载体和非病毒载体。

　　2.1　病毒载体

　　病毒载体由于具有较高的转染效率而成为基因治疗中应用最为广泛的载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。

　　2.1.1　逆转录病毒　可以把外源基因以前病毒的形式转移到靶细胞基因组中，并持久表达，故在胃肠癌的基因治疗中作为首选载体。Caruso等^〔2〕将TK基因逆转录病毒载体的包装细胞直接注射到小鼠结肠癌肝转移灶，辅以GCV治疗后，瘤体明显减小，残余癌组织呈现大量纤维化，同时观察到旁观者效应及大量CD^＋₄、CD^＋₈ T淋巴细胞在癌周浸润。Yoshida等^〔3〕用逆转录病毒携带HSV-TK基因经脂质体包裹后转导胃癌细胞株TMK-1，给不同浓度(0.1～100μg/ml)的GCV治疗，转基因癌细胞(TMK-TK)均有死亡，并呈现时间剂量依赖关系。将1×10⁶个TMK-TK细胞接种到裸鼠皮下，2周后腹腔注射GCV〔20mg/（kg*d）×14d〕，结果实验组中13只动物有12只瘤体直径由治疗前平均6.5 mm减小到小于1 mm。Huber等^〔4〕克隆了大肠杆菌CD基因，用逆转录病毒将CD基因导入结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)细胞系(WiDr)，证明转染细胞(WiDr/CD)并未改变其在体外及裸鼠体内的生长速度，但5-Fc对癌细胞的半数抑瘤浓度(IC₅₀)从26 000 mmol/L(对WiDr)下降到27 mmol/L(对WiDr/CD)。体内实验表明，单次腹腔注射5-Fc 500 mg/kg，可使血浆浓度短期内达到4 100 μm/ml，表达CD的移植瘤在连续15天腹腔注射5-Fc后，瘤体完全消退。

　　逆转录病毒载体存在一些局限性：①繁殖滴度低，目前能达到的滴度(10⁷)达不到治疗大肿瘤所需的滴度；②容量小，只能容纳8 kb的外源基因片段；③宿主范围有限，只感染增殖细胞；④血清补体能使之失活；⑤可能引起插入突变。因而在一定程度上限制了进一步应用。

　　2.1.2　腺病毒载体　能产生更高病毒滴度(＞10¹¹)，转染效率高，可以感染非增殖细胞，在直接体内途径(in vivo)基因转移上有较大优势，且不整合到宿主细胞基因组中，无潜在致癌危险，故在基因治疗中腺病毒载体的应用渐渐增多。Tanaka等^〔5〕将2×10⁶个胃癌细胞(MKN45)接种到裸鼠皮下，第3天瘤体直径达3～4 mm，然后将癌胚抗原(CEA)启动子与TK基因相接，构建嵌合基因pCEA/TK，用腺病毒载体直接注入瘤体，经GCV作用后，瘤体生长明显受抑。Hirschowitz等^〔6〕用巨细胞病毒(CMV)启动子调控CD基因，构建腺病毒载体AdCMV.CD，体外转染结肠癌细胞株HT29，结果显示转染了CD基因的HT29细胞(HT29/CD)对5-Fc的敏感性显著提高；混合野生型HT29细胞及HT29/CD细胞，当后者只占10%时，即可对野生型细胞产生明显杀伤作用，且证明这种旁杀作用无需细胞接触；体内实验结果显示荷瘤小鼠经瘤体内注射AdCMV.CD及5-Fc，瘤体体积比对照小4～5倍。虽然腺病毒载体近来发展迅速，但重组病毒可导致转染细胞毒性及细胞死亡，使基因表达时间受限，并且病毒抗原可诱导机体产生免疫反应，限制重复应用。目前许多研究集中在对免疫反应进行调节和修饰，以提高腺病毒载体基因治疗的效果。

　　2.1.3　其它病毒　也存在若干问题，如腺相关病毒重组病毒滴度低(10⁴)，且需辅助病毒提供缺失的病毒基因；单纯疱疹病毒有天然嗜神经性，该病毒基因组量大(150 kb)，其特性尚未完全清楚。到目前为止，尚无一种病毒载体达到低毒、高效、容量大、可控基因转录和表达。因此病毒载体的应用研究尚需进一步加强。

　　2.2　非病毒载体

　　这类载体如脂质体、分子共轭、裸DNA等多通过机械方式导入肿瘤组织，其转染效率低，稳定性差，缺乏靶向性，临床适用性差，因而极少用于胃肠道肿瘤的基因治疗。目前有研究表明：该类载体被一些特异性配基修饰后，可使它具有一定亲嗜性，并提高稳定性和转染率，有望成为一种较为理想的基因载体。

　　3　靶向性表达

　　肿瘤自杀基因治疗用于临床，其关键的一步是要求自杀基因准确、特异地表达于肿瘤局部，避免导入正常组织细胞中而引起不良反应。目前所用的靶向方法主要有靶向性转导和靶向性转录两种方式。

　　3.1　靶向性转导

　　普通的病毒载体和脂质体等导入外源基因的方法都缺乏组织细胞特异性，如使这些载体表面带上肿瘤细胞特异性的识别分子，通过这些分子引导载体到达特定肿瘤细胞，从而将所携带的外源基因带入细胞内，如假型化逆转录病毒、病毒/配体复合物、脂质体/配体复合物等。这方面的工作正在开展，有可能为胃肠道肿瘤的基因治疗提供有效的基因靶向性载体。

　　3.2　靶向性转录

　　通过将肿瘤组织特异性的调控元件和自杀基因相连接，实现自杀基因靶向性表达，辅以前药治疗后，使肿瘤微环境中浓集毒性产物，增强抗瘤效果。Huber等^〔7〕和Richards等^〔8〕将CEA转录调控元件(TRS)与CD基因相接，构建CEA分泌型癌细胞特异性的自杀基因载体，用之转染人CRC，发现CD酶仅在分泌CEA的转基因细胞中表达，并可被5-Fc杀灭，而不分泌CEA的瘤细胞则不受影响；进一步研究表明，CEA启动子位于转录起始位点-90～+69 bp之间，其中-41～18 bp是启动转录所必需的，将两个上游序列-14.5～-10.7 kb及-6.1～-4.0 kb分别与多聚启动子序列(-89～-40 bp)相连，能显著增强报告基因的表达水平，DNA足迹实验确定CEA启动子功能区位于-90～-17 bp之间。Tanaka等^〔5，9〕将HSV-TK基因置于CEA启动子下游，用重组腺病毒载体转染结肠癌细胞株MKN45及胃癌细胞株MKN28，结果发现TK基因仅在CEA阳性细胞中表达，增加癌细胞对GCV的敏感性，IC 50从300 mmol/L(对亲本细胞)下降到21～5.8 mmol/L(对转基因细胞)。另外Lan等^〔10〕及崔龙等^〔11〕的实验也取得了一致的结果。

　　4　旁观者效应

　　自杀基因抗肿瘤作用不仅引起转导细胞“自杀”，还可以通过旁观者效应(bystander effect, BE)杀伤邻近未导入基因的细胞，扩大杀伤效应。Huber等^〔12〕将CD基因导入CRC细胞株WiDr，混合CD^＋与CD^-肿瘤细胞，5-Fc能抑制CD^-细胞生长。当CD^＋细胞占有1/3时，即可杀灭占2/3的CD^-细胞。这种旁杀作用勿需细胞接触。将不同比例的混合细胞分别接种到裸鼠皮下，当CD^＋细胞只占2%时，瘤体生长即被5-Fc抑制；CD^＋细胞占4%时，同组5只动物经5-Fc治疗后，3只皮下肿瘤消失，另2只瘤体明显缩小；增加CD^＋细胞比例，效果更明显。同样，TK/GCV体系的实验也证实存在显著的旁观者效应，且其强弱与基因表达水平相关。目前认为这种旁杀作用可能与下列因素有关：①转基因细胞死亡后释放凋亡小体，被周围细胞吞噬而引起凋亡，通过阻断凋亡小体的转移可抑制旁观者效应^〔13〕；②毒性代谢产物作用于邻近细胞，抑制未导入基因的细胞的DNA合成，5-Fu可以扩散出入细胞，无需细胞接触，而TK系统的毒性产物经过缝隙连接转移至邻近细胞，这种转移是由细胞间连接子介导的^{〔12，14〕}；③通过激活免疫机能以增强抗肿瘤作用。表达外源基因的肿瘤细胞增强了自身的免疫原性，同时体内通过释放细胞因子(如IL-6等)产生抗肿瘤免疫。研究证实经基因治疗的瘤体内可见大量的CD^＋₄、CD^＋₈ T淋巴细胞及巨噬细胞浸润^〔3，15〕。Mullen等^〔16〕认为细菌CD蛋白可能是一种超抗原，使淋巴细胞多克隆激活而产生抗肿瘤免疫。由于存在旁观者效应，使肿瘤细胞无需很高的转染率即能被药物杀灭，符合临床实用要求。

　　5　联合基因治疗

　　将自杀基因与其它目的基因联合应用可增强疗效，获得最佳抗肿瘤效果，其中以联用自杀基因与细胞因子基因最常见。Chen等^〔17〕用携带TK基因及鼠白介素-2(mIL-2)基因的重组腺病毒载体直接注射入小鼠结肠癌的肝转移灶，同时辅以GCV治疗，发现癌灶显著坏死和消退，并诱导出对远处接种瘤块显著的系统免疫反应，抑制野生型细胞继发接种时的成瘤能力，此免疫力与肿瘤细胞特异性CD^＋₈细胞的存在有关。Chen等^〔18〕进一步联用TK、mIL-2及粒、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因治疗肝转移灶，发现小鼠体内产生的抗肿瘤免疫更持久，明显延长荷瘤动物的生存期。

　　6　结语

　　胃肠道肿瘤自杀基因作为一种全新的肿瘤治疗手段，在基础研究方面取得了可喜的成绩，但实验研究与临床应用尚有相当长的过渡时期。今后的研究应寻找更多更有效的自杀基因，构建更为有效的靶向性载体，提高基因靶向转染效率，选择简便实用的治疗策略，建立合理搭配的联合基因治疗方案等。相信随着这些问题的逐步解决，肿瘤自杀基因治疗能早日造福于人类。

　　参考文献

　　1　Austin EA, Huber BE. A first step in the development of gene therapy for colorectal carcinoma: cloning, sequencing and expression of Escherichia Coli cytosine deaminase. Molecular Pharmecology, 1993; 43(3)∶380

　　2　Caruso M, Panis Y, Gagandeep S, et al. Regression of established macroscopic liver metastasis after in situtransduction of a suicide gene. PNAS, 1993; 90(15)∶7024

　　3　Yoshida K, Kawami H, Yamaguchi Y, et al. Retrovirally transmitted gene therapy for gastric carcinoma using herpes simplex virus thymidine kinase gene. Cancer, 1995; 75(6)∶1467

　　4　Huber BE, Austin EA, Good SS, et al. In vivo antitumor activity of 5-Fluorocytosine on human colorectal carcinoma cells genetically modified to express cytosine deaminase. Cancer Res, 1993; 53(19)∶4619

　　5　Tanaka T, Kanai F, Lan KH, et al. Adenovirus-mediated gene therapy of gastric carcinoma using cancer-specific gene expression in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 1997; 231(3)∶775

　　6　Hirschowitz EA, Ohwada A, Pascal WR. In vivo adenovirus mediated gene transfer of the Escherichia Coli cytosine deaminase gene to human colon carcinoma-derived tumors induce chemosensitivity to 5-Fluorocytosine. Human Gene Ther, 1995; 6(8)∶1055

　　7　Huber BE, Richardi CA, Austin EA. Virus-directed enzyme/prodrug therapy (VDEPT), selectively engineering drug sensitivity into tumors. Ann N Y Acad Sci, 1994; 716(1)∶104

　　8　Richards CA, Austin EA, Huber BE. Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen: identification and use with cytosine deaminase for tumor specific gene therapy. Hum Gene Ther, 1995; 6(7)∶881

　　9　Tanaka T, Kanai F, Okabe S, et al. Adenovirus-mediated prodrug gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human gastric carcinoma cells in vitro. Cancer Res, 1996; 56(6)∶1341

　　10　lan KH, Kanai F, Shiratori Y, et al. Tumor-specific gene expression in carcinoembryonic antigen-producing gastric cancer cells using adenovirus vectors. Gastroenterology, 1996; 111(5)∶1241

　　11　崔　龙， 曹广文， 王元和等. HSV-TK基因体外特异性前药转换抗大肠癌作用研究. 中华外科杂志， 1997； 35(6)∶356

　　12　Huber BE, Austin EA, Richards CA, et al. Metabolism of 5-Fluorocytosine to 5-flurouracil in human colorectal tumor cells transduced with the cytosine deaminase gene: significant antitumor effects when only a small percentage of tumor cells express cytosine deaminase. PANS, 1994; 91(17)∶8302

　　13　Freeman SM, Abboud CN, Whartenby KA, et al. The “bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993; 53(22)∶5274

　　14　Mesnil M, Piccoli C, Tiraby G, et al. Bystander killing of cancer cells by herpes simplex virus thymidine kinase gene is medicated by connexins. PNAS, 1996; 93(5)∶1831

　　15　Christopher CA, Nielsen MD, Donald W, et al. Herpes simplex th-ymidine kinase gene therapy is required for complete regression of murine colon adenocarcinoma. Am Surg, 1997; 63(7)∶617

　　16　Mullen CA, Petropoulos D, Lowe RM, et al. Treatment of microscopic pulmonary metastasis with recombinant autologous tumor vaccine expressing interleukin-6 and Escherichia Coli cytosine deaminase suicide gene. Cancer Res, 1996; 56(6)∶1361

　　17　Chen SH, Chen L, Wang YB, et al. Combination gene therapy for metastasis of colon carcinoma in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92(7)∶2577

　　18　Chen SH, Kosai K, Xu B, et al. Combination suicide and cytokine gene therapy for hepatic metastasis of colon carcinoma: sustained antitumor immunity prolongs animal survival. Cancer Res, 1996; 56(16)∶3758