嗜酸细胞凋亡在激素抵抗型哮喘中的意义

中华结核和呼吸感染 2000年第10期第23卷 论　著

作者：刘春涛　王曾礼　谢敏　袁益明

单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院呼吸内科

　　关键词： 哮喘；嗜酸细胞凋亡；激素抵抗

　　【摘要】　目的　观察激素抵抗型（SR）哮喘是否存在嗜酸细胞（EOS）凋亡功能的异常及促炎症细胞因子白细胞介素5（IL-5）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的调节作用。方法　分离SR（15例）、激素敏感型（SS，30例）两组哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs）及EOS，体外培养后测定：（1）PBMCs在糖皮质激素处理前、后分泌细胞因子的能力；（2）自发的或糖皮质激素诱导的或用PBMCs培养上液处理后的EOS凋亡率及Fas抗原表达率。结果　（1） 糖皮质激素处理前SS组与SR组患者PBMCs分泌IL-5水平（μg/L）分别为196±68、235±98；GM-CSF分泌水平（μg/L）SS组和SR组患者分别为325±110、356±131，两组比较差异均无显著性（P＞0.05）。地塞米松处理后与处理前比较，SR组IL-5水平为（210±75）μg/L，差异有显著性（P＜0.01）；GM-CSF为（312±147）μg/L，差异有显著性（P＞0.01）；SS组IL-5为（147±62） μg/L，差异有显著性（P＜0.01），GM-CSF为（270±97）μg/L，差异有显著性（P＜0.05）。（2）SS组与SR组EOS在体外培养时均发生不同程度的凋亡。EOS基础凋亡率SS组为（67±21）%，SR组为（33±17）%，两组与诱导前比较差异有显著性（P＜0.001）。Fas抗原表达率SS组为（54±23）%，SR组为（27±15）%，两组比较差异有显著性（P＜0.001）。地塞米松诱导后，SS组凋亡率为（89±20）%，与诱导前比较差异有显著性（P＜0.01），Fas表达率为（60±17）%，与诱导前比较差异无显著性（P＞0.1）。SR组EOS诱导凋亡率和Fas表达率分别为（41±18）%、（35±13）%，与诱导前比较差异无显著性（P均＞0.1）。同一患者的PBMCs培养上液可对抗地塞米松诱导EOS凋亡的作用，以SR组更为明显。结论　SR患者的EOS存在自身凋亡功能的缺陷并对激素诱导凋亡作用不敏感，同时Th2细胞分泌促炎症细胞因子的活性不能为激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。

Effect of eosinophil apoptosis on glucocorticoid-resistant asthma

LIU Chuntao, WANG Zengli, XIE Min, et al.

　　(Division of Respiratory Medicine, The First Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)

　　【Abstract】　Objective　To investigate the function of eosinophil apoptosis and regulation of glucocortico steroids on IL-5 and GM-CSF expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in glucocorticoid-resistant asthmatic patients. Methods　Eosinophils (EOS) and PBMCs isolated from glucocorticoid-sensitive (SS, 15 cases) and resistant (SR, 30 cases) asthmatic subjects were cultured and treated with dexamethasone (DXM) in vitro. Concentrations of IL-5 and GM-CSF were determined by ELISA in the supernatants recovered in sham and DXM treated cells. The rates of EOS apoptosis and Fas antigen expression were documented via flow cytometer in sham, DXM treated and PBMC supernatant treated groups respectively. Results　There were no statistical significant differences of the concentrations of both IL-5 and GM-CSF in sham cultured PBMC supernatants between SS and SR groups ［(196±68) μg/L vs. (235±98 ) μg/L IL-5 (P＞0.05), (325±110) μg/L vs. (356±131) μg/L GM-CSF (P＞0.05); SS versus SR groups, respectively］. There were statistically significant decreases in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SS group ［(196±68) μg/L vs. (147±62) μg/L IL-5 (P＜0.01); (325±110) μg/L vs.(270±97) μg/L GM-CSF (P＜0.01)］. In contrast, there were no significant differences in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SR group. Baseline rates of both EOS apoptosis and Fas antigen expression were statistically significant different between SS and SR groups ［(67±21)% vs. (33±17)% the rate of EOS apoptosis (P＜0.001); (54±23)% vs.(27±15)% the rate of Fas antigen expression (P＜0.001), SS versus SR groups, respectively］. A dramatic increase in EOS apoptosis after DXM exposure was observed in SS group ［(67±21)% vs. (89±20)% (P＜0.01), baseline vs. DXM exposure, respectively］, but there was no significant change in Fas antigen expression. There were no significant changes in both EOS apoptosis and Fas antigen expression in SR group after DXM exposure. Conclusions　These data suggest that EOS compromised apoptosis might exist and could not be affected by glucocorticoid induction in SR asthma. On the other hand, Th2 cytokine over-expression could not be inhibited by glucocorticoid in SR group in vitro.

　　【Key words】　Asthma;　Eosinophil apoptosis;　Glucocorticoid resistant

　　依据对糖皮质激素（GC）治疗的反应性，哮喘患者可分为激素敏感型（SS）、激素依赖型（SD）与激素抵抗型（SR）。激素抵抗型患者一般病程较长，气道高反应性较严重，即使给予大剂量的糖皮质激素治疗，疗效亦不理想，临床处理较为棘手。近年来对于哮喘激素抵抗的机制进行了广泛的研究，发现此类患者T细胞及嗜酸细胞（EOS）表面GC受体的亲和力下降，单核细胞表面补体受体表达缺陷，局部存在高浓度的炎性转录因子如激活肽1（AP-1）、转录因子κB（NF-κB）等^［1］。EOS作为哮喘气道炎症的主要效应细胞，其凋亡与抗凋亡机制近年倍受重视，一般认为EOS凋亡是气道炎症消退的重要途径之一，而哮喘时存在EOS凋亡不足。但EOS凋亡与激素抵抗的关系，迄今的研究甚少涉及。我们通过对一组SS和SR哮喘患者EOS凋亡现象及其调控机制的比较研究，试图了解：（1）哮喘的激素抵抗是否与EOS凋亡功能低下有关；（2）激素抵抗时促炎症细胞因子白细胞介素5（IL-5）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的表达水平及其对EOS凋亡的调控作用。

　　对象与方法

　　一、对象

　　哮喘患者45例，均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的诊断标准^［2］。所有患者基础一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值％）≤75％，支气管舒张试验阳性（FEV₁占预计值％改善≥15％）。受试者无严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤，受试前1个月未使用免疫调节剂或细胞毒药物。其中SS 30例，SR 15例，标准：口服泼尼松20 mg/d 1周，FEV₁占预计值％改善≥25％为激素敏感型，≤15％为激素抵抗型。

　　二、设备和试剂

　　紫外分光光度仪（U-3400，日本日立公司）、751 GW型分光光度仪、酶标仪、流式细胞检测仪（Coulter Elitee ESP，法国）。人IL-5酶联免疫(ELISA)试剂盒，人GM-CSFELISA试剂盒（ENDOGEN，美国）、FITC标记抗CD₉₅，碘化丙啶（PI）染液（美国Sigma公司，工作液50 μg/ml），细胞固定-打孔试剂盒（IntraPrep^TM Permeabilization Reagent，法国Coulter公司）。

　　三、方法

　　1.外周血单个核细胞（PBMC）与嗜酸细胞的分离和制备：停用泼尼松2周以后，采取外周静脉血20 ml，肝素抗凝，等体积Hank液稀释、混匀，用淋巴细胞分离液（深圳华美公司分装）分离获取PBMC，用Hank液洗涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。取管底颗粒细胞重悬于相对密度为1.070含10％小牛血清的percoll液。制备4个不同密度的percoll液，密度分别为1.08 kg/L、1.09 kg/L、1.095 kg/L、1.10 kg/L，依次加入10 ml离心管铺成不连续密度梯度。将上述细胞悬液取2 ml加入离心管中，4 ℃、3 000 r/min离心20 min后，吸取1.095～1.10 kg/L界面的细胞^［3］涂片，Wright-Giemsa染色证实EOS＞90%，台盼蓝拒染法细胞活力＞95％。细胞浓度调整为1×10⁵/ml。

　　2.PBMC体外培养及细胞因子检测：PBMC以无血清RPMI 1640培养液洗涤，制成细胞悬液，置96孔培养板，每份2孔，每孔细胞数1×10⁵ ml，加入植物血凝素（PHA）终浓度为50 mg/L，其中1孔加入地塞米松（DXM，美国Sigma公司），终浓度为10^-6mol/L，孵育24 h（37 ℃，5％ CO₂），吸取上液，以IL-5、GM-CSF ELISA试剂盒测定IL-5和GM-CSF浓度。

　　3.EOS体外培养：EOS以无血清RPMI 1640液洗涤。制成细胞悬液，加入96孔培养板中，细胞浓度为每孔10⁴ ml，每一受试者分为3孔，其中2孔分别加入：（1）DXM，终浓度为10^-6mol/L；（2）DXM（10^-6mol/L）+同一受试者PBMC培养上液10 μl。体外孵育72 h（条件同上）。

　　4.EOS凋亡率与Fas抗原检测：取70 μ孔径尼龙筛网过滤孵育EOS，滤过液低速离心1 000 r/min，3 min，去上清；调整细胞浓度为10⁴/ml，加入CD₉₅-FITC10U，按操作程序在室温避光孵育15 min后，加入5 ml PBS缓冲液离心洗涤，去上清。细胞固定打孔；经以上步骤处理的细胞转入流式上机试管，加入1 ml PI工作液作DNA染色，15 min后上机检测；由流式细胞仪专用数据分析软件（Elitee）进行数据处理。凋亡细胞与CD₉₅（Fas）阳性细胞分别以占总细胞数的百分数表示。

　　统计学处理：所有数据采用±s表示，用SPSS软件进行t检验分析。

　　结果

　　一、 SS组与SR组哮喘患者PBMC产生细胞因子水平的差异

　　我们的试验显示，哮喘患者PBMC可在体外培养时分泌两种主要的促炎症细胞因子IL-5和GM-CSF，其基础分泌水平SR组较SS组患者略高，但二者比较差异无显著性（P＞0.05）。预先在培养液中加入DXM，对SR组患者的PBMC产生细胞因子有轻度影响，与基础水平比较差异无显著性（P＞0.05），但可显著地使SS组PBMC产生的细胞因子浓度明显下降，提示激素抑制PBMC的作用在SS型哮喘较SR型哮喘敏感（表1）。

表1　各组PBMC培养上液细胞因子浓度（±s）

　　注： 与自发分泌比较^*P＜0.05；与SS组比较^**P＞0.05　　二、EOS凋亡与激素抵抗的关系

　　体外培养72 h后，SS组与SR组患者的EOS均发生不同程度的凋亡。SS组表现较高的基础凋亡率为67±21和Fas抗原表达率为54±23，与SR组（33±17，27±15）比较差异有显著性（P均＜0.001），若用DXM诱导，凋亡率进一步升高（89±20，与自发凋亡率比较（P＜0.01)，但Fas表达率（60±17）与诱导前比较差异无显著性（P＞0.1）。SR组不仅EOS自发凋亡率和Fas表达率较低，且用地塞米松诱导后凋亡的水平变化较小（41±18，35±13），与诱导前比较差异无显著性（P均＞0.1）。加入同一个体的PBMC培养上液与地塞米松共同培养，可使凋亡率和Fas表达率降低，显示PBMC培养上液有对抗地塞米松诱导EOS凋亡的作用，但仅SS组Fas表达率和SR组凋亡率的降低与单独用地塞米松比较差异有显著性（P＜0.05及＜0.001，表2）。

　　讨论

　　目前已经明确EOS是参与哮喘气道炎症最主要的效应细胞， EOS募集入肺并释放损伤性介质是气道炎症的中心环节。近年发现EOS可在气道局部发生凋亡,凋亡时形成的凋亡小体被巨噬细胞吞噬，无内容物外溢，不触发炎症反应，因此EOS凋亡是气道炎症消退的有效途径，而局部凋亡-抗调亡机制失衡是气道炎症发展、持续的重要因素。

　　一般认为哮喘气道炎症时凋亡机制异常可能表现为凋亡不足或凋亡延迟。如钱桂生等^［4］报道，哮喘组EOS凋亡率为（2.1±1.3）%，而对照组为（10.1±3.4）%，并推测凋亡抑制基因Bcl-2和白细胞介素1 β转化酶（ICE）过度表达可能是哮喘气道EOS凋亡不足的原因之一。有证据表明，GC抑制气道炎症的作用部分来自其诱导EOS及其它炎性细胞凋亡的活性。Wolley等^［5］在1996年首次证实，GC治疗可使哮喘患者临床症状改善，气道中EOS明显减少，凋亡率明显增加，并被巨噬细胞所吞噬。GC通过诱导气道上皮细胞产生Fas而诱导EOS凋亡。近期国内亦有数项研究涉及GC对EOS凋亡的影响，如欧阳能太等^［6］发现，DXM处理后的哮喘豚鼠，其气道中淋巴细胞（CD⁺₄）减少，原因之一在于淋巴细胞凋亡增加。周向东等^［7］则报道，在体外培养中，哮喘患者外周血分离的多形核白细胞(PMN)、EOS、T淋巴细胞（TLC）凋亡延迟，显示处于凋亡抑制状态，而加入GC于培养基中，可显著增加EOS和TLC的凋亡，但却抑制PMN的凋亡，显示GC对肺部炎性效应细胞凋亡作用有一定异质性。GC对EOS凋亡的影响可能通过两个途径：（1）阻断Th2 CK基因的表达，使支持EOS存活的IL-3、IL-5、GM-CSF产生减少；（2）可能参与凋亡基因与受体的调节，如加强抗Fas单抗活性，活化EOS表面Fas等。

表2　各组EOS凋亡率与Fas表达水平（%，±s）

　　激素抵抗型哮喘属于哮喘的一种少见的特殊类型，关于其诊断标准目前尚未取得一致意见，通常的定义为在保证依从性前提下，规则口服泼尼松每天40 mg，疗程2周，其FEV₁占预计值%（＜75%）的改善＜15%^［1］。但亦有作者提出异议，认为每天40 mg的剂量过大，对患者有一定的危险性，对中国人而言剂量尤嫌偏大。故国内孙永昌等^［8］提出的修订标准所采用的给药方案为口服泼尼松每天20 mg，疗程7 d，我们亦采用此一方案。现有资料显示，哮喘时存在EOS凋亡延迟，而糖皮质激素的抗炎平喘作用可能与其诱导EOS及淋巴细胞凋亡有关，但对于哮喘中的激素抵抗现象是否与凋亡有关，目前尚缺乏重视。我们的试验证实，SS和SR组患者的EOS均可在体外培养时自发地凋亡并表达凋亡基因相关产物Fas抗原，而SR组患者的凋亡水平明显高于SS组，提示激素抵抗时存在EOS凋亡功能的低下。激素在体外培养时可显著诱导SS组患者的EOS凋亡，而对SR组患者EOS凋亡水平影响甚微，进一步说明激素抵抗的机制可能涉及EOS对激素诱导凋亡的不敏感。分析其原因可能有：（1）凋亡受到相关基因的控制，Fas/APO-1是主要的凋亡促进基因，编码的膜蛋白Fas/APO-1抗原激活后可诱发细胞凋亡，而Bcl-2据认为是主要的凋亡抑制基因。正常或哮喘时气道与外周血EOS表面均可表达Fas/APO-1（CD₉₅）。Druithe等^［9］发现，EOS在培养后48～72 h 后，EOS表面更易于测出CD₉₅，但以培养6～12 h的EOS对抗Fas诱导的凋亡更为敏感。我们的试验显示，SR组自发的与激素诱导的EOS表面Fas抗原表达率均低于SS组，提示激素抵抗时EOS凋亡不足与Fas基因表达缺陷有关。因未测定Bcl-2抗原，故不能确定是否有凋亡抑制基因的异常；（2）炎症局部产生的细胞因子或其它介质，在调控EOS凋亡中亦发挥重要的作用。Th2型CK包括IL-5、GM-CSF、IL-3不仅对EOS有趋化与功能活化作用，大量实验证明，亦是主要的EOS存活维持因子，即主要的抗凋亡因子。卵蛋白(OVA)致喘小鼠的EOS在体外培养时，若无IL-5或GM-CSF支持，在72 h几乎全部凋亡，培养液中IL-3，IL-5或GM-CSF与维持EOS活力（抗凋亡）效应之间存在浓度依赖关系^［10］。我们发现，糖皮质激素可在体外培养时显著抑制SS患者的PBMC（以淋巴细胞为主）在体外培养时释放IL-5和GM-CSF的能力，分析其机制除与激素直接抑制细胞因子的合成有关以外，亦可能与其诱导淋巴细胞凋亡有关。这一结果与孙永昌等^［8］所观察到激素对SR患者T细胞增殖的抑制作用显著低于SS患者的现象吻合。激素对SR组患者的PBMC在体外分泌促炎症细胞因子的活性影响较小，反映出较高水平的Th2细胞来源的细胞因子对EOS的生长支持作用，是EOS凋亡不足的另一原因。同一个体的PBMC培养上液（含有上述细胞因子）可使EOS的凋亡率更为低下，并加强对激素诱导凋亡的抵抗，进一步反映出促炎症细胞因子对EOS凋亡的影响。从我们的试验可以得出如下结论：（1）糖皮质激素抵抗患者的EOS存在自身凋亡功能的缺陷；（2）此类患者同时存在Th2细胞分泌促炎症细胞因子的活性不能为激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。进一步研究激素与细胞凋亡的关系，有助于深入了解激素抵抗这一特殊的临床现象，并为临床治疗提供指导，或作为临床诊断SR型哮喘的辅助指标。已发现某些药物如茶碱、大环内脂类抗生素与环孢素A可诱导EOS凋亡，且环孢素A对某些糖皮质激素抵抗型哮喘亦有较好疗效，故增加EOS凋亡的途径，可能是针对激素抵抗型哮喘的可行的选择。　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39570329）

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(收稿日期：2000-03-21)