支气管哮喘患者粒-巨噬细胞集落刺激mRNA表达的研究

中华结核和呼吸感染 2000年第9期第23卷 论著

作者：张伟　钟南山　徐军

单位：张伟（现在广东省人民医院呼吸科，510080）；张伟 钟南山 徐军（510120广州呼吸疾病研究所）

　　关键词： 哮喘；气道炎症；粒-巨细胞集落刺激因子

　　【摘要】　目的　探讨利用无创伤性方法寻找较为特异性地反映哮喘患者气道炎症的客观指标。方法　通过研究哮喘患者气道粘膜细胞粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） mRNA表达，并以此为参照，分析哮喘患者诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达变化，利用免疫组化结合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)技术，分析哮喘组（10例）气道粘膜细胞GM-CSF mRNA的表达；用3%高渗盐水诱导痰液，利用RT-PCR技术分析哮喘组(15例)、慢性支气管炎组（15例）和对照组（11例）诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达。结果　（1）哮喘组气道粘膜嗜酸细胞、淋巴细胞和活化嗜酸细胞（EG⁺₂细胞）分别为（17.9±7.0）×10²、（36±13）×10²和（8.9±3.0）×10²个/mm²，对照组分别为（1.9±1.0）×10²、（6±5）×10² 和（0.8±0.2）×10²个/mm²，EG₂细胞数与病情程度呈正相关(r=0.82，P＜0.05)；（2）哮喘组气道粘膜细胞GM-CSF mRNA表达为(1.4±0.6)，与对照组(0.3±0.3)比较，差异有显著性(P＜0.05)，并且GM-CSF mRNA的表达与EG⁺₂细胞数明显相关(r=0.73，P＜0.05)。（3）哮喘组诱导痰嗜酸细胞相对计数为（0.334±0.067），与慢性支气管炎组的（0.021±0.004）和对照组的（0.008±0.003）比较，差异均有显著性(P＜0.05)；（4）哮喘组诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达为(0.320±0.054)，与慢性支气管组的(0.188±0.024)和对照组的(0.058±0.028)比较，差异均有显著性(P＜0.05)；慢性支气管炎组与对照组比较，差异也有显著性(P＜0.05)。结论　诱导痰细胞GM-CSF mRNA过度表达能够较为特异地判断哮喘气道炎症。

Expression of GM-CSF mRNA in asthmatic patients

ZHANG Wei，ZHONG Nanshan，XU Jun.

　　（Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, Guangzhou 510120, China）

　　【Abstract】　Objective　To explore non-invasive and specific markers for airway inflammation.　Methods RT-PCR methods were used to measure GM-CSF mRNA expression in airway mucosa and induced sputum from asthmatic patients. The correlation was analyzed between expression of GM-CSF mRNA and eosinophils or other inflammatory cells.Results (1) The numbers of eosinophils and EG₂ positive cells were (17.9±7.0)×10² per mm², and (8.9±3.0)×10² per mm² in the asthmatic group, significantly higher than those in the non-asthmatic control which were (1.9±1.0)×10² per mm², and (0.8±0.2)×10² per mm², respectively (P＜0.05). (2) The expression of GM-CSF mRNA was (1.4±0.6) in the asthmatic group, significantly higher than that in the control group (0.3±0.3) (P＜0.05), and GM-CSF mRNA expression was correlated with the numbers of EG₂ positive cell (r=0.73 and P＜0.05). (3) The percentage of eosinophils in induced sputum from asthmatic patients was （0.334±0.067）, which was significantly higher than that from chronic bronchitis and control (0.021±0.004),（0.008±0.003）（P＜0.05). (4) The expression of GM-CSF mRNA in asthmatics was (0.320±0.054), significantly higher than that in chronic bronchitis and the control group (0.188±0.024 and 0.058±0.028)（P＜0.05). The expression of GM-CSF mRNA in patients with chronic bronchitis was also significantly higher than that in the control group (P＜0.05).Conclusions The expression of GM-CSF mRNA in induced sputum may be a relatively specific marker for airway inflammation.

　　【Key words】　Asthma;　Airway inflammation;　Granulocyte macrophage-colony stimulating factor

　　支气管哮喘基本的病理特征是由多种细胞包括肥大细胞、嗜酸细胞和淋巴细胞等参与形成的气道慢性炎症。活化嗜酸细胞（EG⁺₂细胞）是气道炎症的主要效应细胞，细胞因子在炎症形成和维持中起重要的调节作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通过调节嗜酸细胞活化、粘附和趋化等在气道炎症形成和维持中起重要作用^［1，2］。哮喘患者气道EG⁺₂细胞数增加与气道粘膜细胞GM-CSF mRNA 表达总量的关系，目前报道较少。我们通过分析哮喘患者气道粘膜细胞GM-CSF mRNA表达与嗜酸细胞、临床表现的关系，在分子水平上寻求反映气道炎症指标，并以此为基础进一步分析哮喘患者诱导痰细胞GM-CSF mRNA的表达，旨在通过非创伤性方法寻找反映哮喘气道炎症较为理想的客观指标。

　　对象与方法

　　一、对象

　　将行纤维支气管镜（纤支镜）检查的18例受试者分为两组。哮喘组10例，男3例，女7例，平均年龄（33±3）岁，诊断参照1997年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组推荐标准，病情分级按照哮喘非急性发作期分级^［3］。根据美国心肺血液研究院（NHLBI）关于哮喘患者纤支镜检查指南中的规定，我们选择临床分级在Ⅰ～Ⅲ级的哮喘患者。其中病情分级为I级者3例，Ⅱ级者3例，Ⅲ级者4例。对照组8例，男4例，女4例，平均年龄（34±3）岁，均为肺内局部阴影需作纤支镜检查的非哮喘患者。哮喘组和对照组患者均为广州呼吸疾病研究所门诊或住院患者。

　　将行诱导痰检查的41例受试者分为三组。哮喘组15例， 男7例，女8例，平均年龄（37±3）岁，其中病情分级为I级者3例，Ⅱ级者3例，Ⅲ级者4例，Ⅳ级者5例。诱导痰检查与上述纤支镜检查者之间无重复。慢性支气管炎组15例，男9例，女6例，平均年龄（58±2）岁，对照组11例（1例诱导痰失败），男5例，女6例，平均年龄（39±3）岁。所有受试者试验前2周内均未口服和吸入糖皮质激素，6个月内未肌肉注射糖皮质激素。哮喘和慢性支气管炎组患者均来自广州呼吸疾病研究所门诊或住院部，对照组来自广州呼吸疾病研究所职工体检自愿者。

　　二、样本的制备

　　进行纤支镜检查的患者，每例于右上叶嵴、右中叶嵴分别钳取粘膜组织3～4块，2块放入1%多聚甲醛中固定，其余放入4 mol/L D 液［250 g异硫氰酸胍（美国Serva公司） 65 ℃溶于293 ml水中，加入0.75 mol柠檬酸钠液17.6 ml和10% N-十二烷基肌氨酸钠26.4 ml混匀，0.22 μm滤膜过滤后4 ℃备用，使用前取100 ml加入0.7 ml β-巯基乙醇混合后即D液］的Eppendoff管提取细胞总RNA。将固定的组织块经酒精梯度脱水、透明处理、浸蜡、石蜡包埋后连续切3张片，每张厚度4 μm，第1张行HE染色，第2和第3张组织切片均用链霉素抗生物素-过氧化酶连接法（SP）进行免疫组化染色。第2和第3张切片分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）、抗活化嗜酸细胞（EG₂）单抗(羊抗人，浓度1∶10，美国PharMingen公司)作为第一抗体，SP试剂盒(丹麦DAKO公司)，DAB显色，阳性反应呈棕褐色，加入抗EG₂单抗的玻片最终经伊红染色，阳性反应呈棕红色颗粒。

　　三、操作步骤

　　用3%高渗盐水，经射流式雾化器（雾化颗粒平均直径4.8 μm）使受试者雾化3～30 min，将诱导痰液4～5口留置在培养皿中，尽量除去唾液，加入10%连硫苏糖醇5～10 ml，冰浴下吹打至痰液粘稠度下降，将混合液充入细胞计数池进行白细胞计数；其余液体经1 000 r/min离心10 min，弃上清，取少许细胞沉淀涂片后经HE染色，按常规方法细胞分类计数。

　　气道粘膜组织诱导痰细胞总RNA提取按照异硫氰酸胍一步法^［4］，逆转录试剂盒(美国Promega公司)，PCR试剂盒(北京华美生物工程有限公司)，PCR引物合成(上海细胞所合成)，β-actin引物序列^［5］：上游5′ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG 3′，下游 5′CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC 3′，此对引物可扩增出836 bp的片段；GM-CSF引物序列^［6］：上游5′ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG C 3′，下游5′CTG GCT CCC AGC AGT CAA AGG G 3′，此对引物可扩增出424 bp的片段。PCR反应条件：变性温度94 ℃、时间1 min，退火温度55 ℃、时间2 min，延伸温度72 ℃、时间2 min，共40个循环；加强延伸温度72 ℃、时间10 min，4 ℃保存。反应完成后，取15 μl PCR产物和PCR Marker（分子量标准）点样在1.5% 琼脂糖凝胶的样板孔里，凝胶中含有0.5 μg/ml的溴化乙锭(EB)显色，电泳电压0.5 V/cm、时间60 min。电泳结束后，立即在紫外图像分析仪（英国UVP公司）摄影记录和测定荧光亮度，最后计算样本GM-CSF与β-actin荧光亮度比值。

　　四、统计学处理

　　所有数据经SPSS软件处理，数值以±s表示，两组间均数的比较采用方差分析，相关分析采用Spearman相关分析，样本间百分含量比较采用Kruskal-Wallis检验。

　　结果

　　哮喘组与对照组的气道粘膜组织炎性细胞总数、嗜酸细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞数和EG₂阳性细胞数统计结果见表1。两组数值比较，差异均有显著性(P＜0.05)；EG⁺₂细胞数与病情程度呈正相关(r=0.82，P＜0.05)。哮喘组气道粘膜细胞GM-CSF mRNA的表达率与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)，粘膜细胞GM-CSF mRNA的表达与炎性细胞总数呈正相关（r=0.65，P＜0.05），与EG₂细胞数呈明显正相关(r=0.73，P＜0.05)，与嗜酸细胞计数无显著相关性（r=0.67，P＞0.05），GM-CSF mRNA表达与病情程度无明显相关性（r=0.48，P＞0.05）。

表1　对照组与哮喘组气道粘膜活检组织炎性细胞数以

　　及CM-CSF与β-actin mRNA比值分析(±s)

　　哮喘组诱导痰嗜酸细胞相对含量与慢性支气管炎组和对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)；哮喘组中性粒细胞相对含量与慢性支气管炎组和对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。哮喘组诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达率与慢性支气管炎组和对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)，且慢性支气管炎组与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05，表2)。诱导痰细胞GM-CDF mRNA表达与各种炎性细胞（嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）相对计数无明显相关性（r分别为0.37，0.24，0.44，0.16，P均＞0.05)。

表2　对照组与哮喘组诱导痰炎性细胞相对计数和GM-CSF与β-actin mRNA比值分析（±s）

　　注：哮喘组与对照组和慢性支气管炎组比较^*P＜0.05，慢性支气管炎组与对照组比较^**P＜0.05　　气道粘膜的各种炎性细胞计数、粘膜细胞GM-CSF mRNA与一秒钟用力呼气容积（FEV₁）和支气管激发试验中引起FEV₁降低20%时吸入组胺含量（PD₂₀）之间无显著相关性（P＞0.05）；诱导痰的各种炎性细胞相对计数、细胞GM-CSF mRNA表达与FEV₁和PD₂₀之间无显著相关性(r分别为0.42，0.52，P均＞0.05）。

　　讨论

　　嗜酸细胞主要通过释放具有较强细胞毒作用的碱基蛋白发挥生物学效应，其中以嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)的细胞毒性最强。EG₂是抗ECP的抗体，EG₂阳性（EG₂）反映嗜酸细胞处于活化分泌状态。哮喘患者气道粘膜的EG₂阳性细胞数明显增加，并且EG⁺₂细胞数与临床病情呈显著正相关。本组试验结果与其他报道一致^［1，2］。

　　GM-CSF是一种多向性和多效性的因子，参与调节嗜酸细胞成熟、分化、活化和脱颗粒以及凋亡等过程^［7］，在哮喘气道炎症的形成和维持中发挥重要作用。炎性细胞(T淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱细胞等)和结构细胞(气道上皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等)通过信号传递系统，使GM-CSF的基因表达上调引起合成和分泌GM-CSF增加，Humbert等^［8］利用原位杂交方法发现哮喘患者气道上皮表达GM-CSF基因的细胞数增加。本组研究发现，正常人气道粘膜细胞有少量GM-CSF基因表达，哮喘患者GM-CSF基因表达明显增加并且与EG₂阳性细胞数呈显著正相关；而气道粘膜EG₂阳性细胞数与病情程度呈正相关，可能与哮喘患者气道局部、通过上调其基因表达，GM-CSF参与嗜酸细胞在气道局部的活化和聚集有关。因此，哮喘患者气道粘膜细胞GM-CSF mRNA表达水平增加，在判断气道炎症中有重要意义，其过度表达可能反映了体内嗜酸细胞聚集和活化的严重性增加，预示气道炎症的加重，能够较为客观地反映气道炎症。

　　Fahy等^［9］在比较了诱导痰、气道粘膜组织和支气管肺泡灌洗液以后认为，三种方法炎性细胞相对含量的差异很大，嗜酸细胞相对量却一致增加，而且诱导痰的嗜酸细胞相对含量最高。本组试验中仅1例诱导痰失败，其余在3～25 min内均成功诱导出痰液，痰涂片鳞状上皮细胞比例3.4%～5.1% ，哮喘组嗜酸细胞占有核细胞总数33.4%，明显高于文献报道^［9，10］，考虑可能与诱导痰的方法、患者的选择以及不同观察者之间判断的差异有关。诱导痰除细胞生存较好和涂片质量较高外，其余特点与自主排痰相似。利用诱导痰方法研究哮喘较为安全、结果可重复性好，但其方法学还有待于标准化，以提高不同实验室之间诱导痰液分析的可比性。

　　哮喘患者诱导痰细胞炎性因子基因表达的研究，国内、外报道不多。1997年赵海涛等^［10］报道哮喘和慢性支气管炎患者诱导痰细胞TNF-α mRNA表达增加。本组研究证实，诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达在哮喘组最高，其次是慢性支气管炎组，正常人有少量表达。本组试验结果还提示，诱导痰细胞GM-CSF 基因高度表达壁诱导痰细胞TNF-α基因的过度表达更能特异性地反映哮喘气道炎症。因此，我们认为检测诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达水平有助于监测气道炎症，结合诱导痰样本其他炎性指标如嗜酸细胞相对计数有助于全面了解气道炎症，为哮喘气道炎症诊断提供较为特异的客观指标。

　　金项目：“九五”国家医学科技攻关计划项目资助（96-906-02-18）

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(收稿日期：1999-10-25)