老年冠心病患者载脂蛋白B100基因突变的研究¹

中国老年学杂志 1999年第2期第19卷 论著

作者：冯　颖　朱光泽　何成彦

单位：冯　颖（白求恩医科大学第一临床学院)；朱光泽（长春中医学院附属医院检验科)

关键词：冠心病；载脂蛋白B100；基因

　　摘　要　目的　探讨老年冠心病发病基因水平上的原因，为冠心病的诊断提供理论依据。方法　采用PCR与限制性内切酶MspⅠ酶切的方法对183例老年冠心病患者进行了载脂蛋白B100基因突变的研究。结果　74例心绞痛病例中，基因水平有改变者为18例(24.4%)；10例心肌梗死患者基因水平有改变者3例(33.3%)，余者基因水平无改变。结论　老年冠心病患者中心绞痛和心肌梗死两类冠心病部分病人病因与其基因水平碱基突变有关。

Apolipoprotein B 100 gene mutation in

　　elderly coronary heart disease patients

He Chengyan,Feng Ying,Zhu Guangze et al

　　The Third Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130031

　　The polymerase chain reaction(PCR) and a cleavage with MspI were utilized to detect apolipoprotein B 100(ApoB 100) gene mutation in 183 elderly patients with coronary heart disease(CHD).The results showed that ApoB 100 gene mutation were observed in 18 out of 74(24.4%) elderly patients with heart-stroke and 3 out of 10(33.3%) elderly patients with myocardial infarction.The results suggested that the pathogeny of the two kinds of CHD-heart-stroke and myocardial infarction in elderly patients were associated with ApoB 100 gene mutation.

　　Key words　Coronary heart disease　Apolipoprotein B 100　Gene

(Original paper see page 73)

　　载脂蛋白B100(ApoB100)参与体内脂质代谢，其水平升高是动脉粥样硬化的重要危险因素^〔1，2〕，而ApoB100基因突变与动脉粥样硬化的相关性是国内外学者研究的热门课题。在人类基因组中，平均约200个碱基对可发生一对变异(称中性突变)。中性突变造成了序列上的多态性，不少序列上的多态性发生在限制性内切酶识别位点上。基于此，我们通过微机检索设计了两条引物，扩增了ApoB100 DNA的片段，并进行MspⅠ酶切，发现ApoB100的cDNA 10.658处为MspⅠ酶切位点。由于此位点碱基改变，导致心肌梗死、心绞痛部分患者ApoB100增加。这对冠心病的基因诊断提供了新的方法，并为该病的病因学研究和发病机理提供了新的方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　1.1.1　实验组　183例为1993～1996年我院心内科住院患者。男103例，女80例，年龄60～76岁，平均64.5岁。心绞痛74例，心肌梗死10例。冠心病诊断符合WHO标准。

　　1.1.2　健康对照组　为同期门诊系统体检健康老年人21例，男16例，女5例。年龄61～70岁，平均64.5岁，均无冠心病、高血压、高血脂、糖尿病及出凝血疾病等。

　　1.1.3　标本来源　研究对象空腹静脉血，EDTA抗凝血各1管。

　　1.2　方法

　　1.2.1　实验仪器　394型DNA/RNA全自动合成仪(ABI公司)；PC-700扩增仪(日本)；CR157平台式离心机(日本)；UV-紫外线分光光度计(日本)；FS-312紫外透射分析仪；电泳仪(日本)；超速离心机；7010半自动分析仪(日本)。

　　1.2.2　主要试剂　ApoB100引物自己设计合成并纯化^〔3～5〕。引物1：5′-CCA ACC CTT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CCC-3′；引物2：5′-CTG TGC TCC CAG AGG GAA TAT ATG GGT TGG-3′。DNA分子量标准PBR 322 DNA-Bst N1 Digest(华美公司提供)。DNA聚合酶dNTPs、MspⅠ、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、琼脂糖、淋巴细胞分离液。

　　1.2.3　实验方法　(1)ApoB100血清学测定：参见伊利康公司ApoB100测定试剂盒。(2)DNA扩增：DNA模板制备参见Peters，Hansen制备^〔6〕PCR反应体系(50 μl)，其成份为：ddH₂O 33 μl，10Xbuffer 5μl，4倍dNTPs(100nmol/L)15μl，ApoB100引物1，2各0.5μl(20 Pmol)，模板4μl。复盖无菌液体石蜡50 μl，置扩增仪中预变性96℃300s，72℃300s，随后96℃90s，44℃ 90s，72℃120s，这样30个循环后延伸10min。(3)MspⅠ消化：取扩增液10μl+10μlMspⅠ37℃过夜。(4)扩增酶切产物检测：取酶切液8μl加入12%聚丙烯酰胺液凝胶电泳槽中，电极以1～8V/cm电泳5～10 h，电泳完毕，将凝胶及其附着玻璃板轻轻地浸入(EB)染液中，染液刚好将凝胶全部没入。于室温染色30～45min，取出凝胶，用紫外透射仪检查结果。

　　2　结　果

　　2.1　老年人ApoB100测定值　见表1。在74例心绞痛患者中，其血清ApoB100异常者为31例(41.0%)，在10例心肌梗死患者中，其血清ApoB100异常者为6例(60.0%)。

表1　老年ApoB100测定值(±s)

　　2.2　酶切产物　正常人的扩增片段可切开为126bp及29bp。异常者仅见一条149bp带。通过对183例患者研究，发现ApoB100的血清学测定心绞痛、心肌梗死患者异常率分别为41.0%和60.0%；而PCR扩增MspⅠ酶切后其基因发生改变心绞痛、心肌梗死患者分别为24.4%及33.3%。3　讨　论

　　从血清学研究结果来看，我们发现心肌梗死、心绞痛患者其ApoB100增高。理论上讲，ApoB100是脂蛋白颗粒中蛋白成分。这种蛋白与脂质结合能力有3种表型，即强结合、弱结合及中等结合。其遗传基础是单一遗传位点上有两个特异的等位基因，一个是强结合，一个是弱结合的形式，中等结合形式的ApoB100是强结合和弱结合两种形式的杂合子^〔7〕。而基因水平碱基突变导致等位基因改变，从而导致脂蛋白与脂质结合能力改变，反映出一部分心绞痛、心肌梗死患者的ApoB100与脂质的结合能力弱，从而在血清中的含量增高。

　　从基因水平酶切结果看，老年性心绞痛和心肌梗死患者其PCR扩增产物MspⅠ酶切后，发生变异情况分别为24.4%及33.3%。这说明两种冠心病与其基因水平碱基突变有关^〔8〕，而这种变化并不是100%；又说明在基因水平上，可能还存在其它位点的碱基突变。至于其突变发生在什么位点，有多少个碱基能产生如此突变，尚待进一步研究。

　　1　本课题系省科委基金资助

　　作者简介：何成彦，男，36岁，主治医师，研究方向：基因诊断何成彦　周劲松　康熙雄　王维忠　(白求恩医科大学第三临床学院检验科，长春　130031)

　　4　参考文献

　　1　叶　平，陈保生，王士雯.应用聚合酶链反应研究载脂蛋白B基因多态性及其临床意义.中华医学检验杂志，1994；17(1)：

　　2　李健斋.提高血脂脂蛋白检验水平的意见.中华医学检验杂志，1994；17(1)：5

　　3　Priestley, Knott, Wallis S et al.RFLP for the human apolipoprotein B gene: 　V;XbaI.Nucleic Acids Res，1985；13：678 98

　　4　Boerwinkle E, Leess, Butler R et al.Rapid typing of apolipiprotein B DNA polymorphisms by DNA amplification:association between Ag epitopes of human apolipoprotein B 100, a signal peptide insertion/deletion polymorphism, and a 3′ flanking DNA variable number of tandem repeats polymorphism of the apoloprotein B gene.Atherosclerosis，1990；81：225

　　5　Erwin H.Analysis of two different tandem repetitive elements within the human apolipoprotein B gene.J of Lipid Research，1990；30：374

　　6　Peters, Hansen.(note on methodology) Detection of the ApoB100-3500 mutation glutamine for arginice, by gene amplification and cleavage with Msp I.J of Lipid Research，1991；32：1229

　　7　吴冠芸，方福德主编.基因诊断技术及应用.北京：北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社，1992：176-177

　　8　叶　平.中国人冠心病载脂蛋白B基因EcoR I酶切多态性的研究.解放军医学杂志，1994；19(3)：180

〔1998-06-27收稿　1998-09-01修回〕