脂蛋白E基因多态性对血脂及冠心病、颈动脉粥样硬化的影响

中华心血管病杂志 1998年第6期第卷 临床研究载

作者：张原力　游凯　张丽华　姜玉新　薛红　陈保生　方圻

单位：100730 中国医学科学院 协和医科大学 北京协和医院内科(张原力、张丽华、游凯、方圻)；超声科(姜玉新)；基础医学研究所 生化国家重点实验室(薛红、陈保生)

　　关键词： 载脂蛋白E类；基因；冠状动脉疾病

　　【摘要】　目的　探讨ApoE基因多态性对中国人血脂水平的影响及与冠心病发病、颈动脉粥样硬化程度的关系。方法　选择96例冠心病患者（CHD组）及131例健康对照者（对照组），测定空腹血清甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度。应用PCR ，HhaI内切酶消化及PAGE的方法确定ApoE基因多态性。采用高分辨二维超声技术测定双侧颈动脉内中膜厚度。结果　CHD组与对照组相比，ApoE基因型频率及ε2，ε3，ε4三种等位基因频率均无显著差异(P＞0.05)；在男性CHD患者及健康对照者，不同的ApoE基因型TC，LDL-C浓度差异均有显著性，并按ε2/2＋ε2/3＜ε3/3＜ε3/4+ε4/4的顺序递增。在女性虽有相似的趋势，但未达统计学显著水平；52例男性CHD患者测定了颈动脉内中膜厚度，并按不同的ApoE基因型分成三组：ε2/2＋ε2/3，ε3/3，ε3/4+ε4/4，结果显示：颈动脉内中膜厚度及多发粥样硬化斑块发生率在不同的ApoE基因型间差异有显著性(P＜0.01)，含ε4等位基因者显著增加，当消除LDL-C的影响后上述差异仍显著(P＜0.05)。结论　ApoE基因多态性是影响血清TC及LDL-C水平的重要遗传因素之一。ApoE基因多态性与颈动脉粥样硬化的程度相关，ε4等位基因是危险因素，但并非仅通过增高LDL-C浓度发挥作用。

Effect of apolipoprotein E polymorphism on serum lipids, coronary heart disease, and carotid artery atherosclerosis

Zhang Yuanli, You Kai, Zhang Lihua, et al. Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the effect of apolipoprotein E polymorphism on serum lipids and the relationship between apolipoprotein E polymorphism and coronary heart disease (CHD) as well as carotid artery atherosclerosis in Chinese people.Methods　Serum triglyceride, total cholesterol (TC), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were measured. Polymerase chain reaction (PCR), HhaI digestion, polyacrylamide gel electrophooresis, and silver staining were used for the detection of apolipoprotein E genotype. In 52 male CHD cases, an extracranial carotid artery high-resolution B-mode ultrasound examination was performed.Results　There were no statistically significant differences in apoplipoprotein E allel or genotype frequences between CHD cases and controls (P ＞0.05). In male CHD cases and controls, the genotypes were associated with serum TC and LDL-C levels in the following order: ε2／2+ε2／3＜ε3／3＜ε3／4+ε4／4(P＜0.01). In women, there were a similar trend but not statistically significant (P＞0.05). The carotid artery intima-media thickness and frequence of multiatherosclerotic plaques were significantly higher in male CHD cases with ε4 allel (P＜0.01 and 0.04), and still did not change the effect of ε4 on intima-media thickness after adjusting for LDL-C levels.Conclusions　Apolipoprotein E gene polymorphism affects serum TC and LDL-C levels in Chinese people. Apolipoprotein E genotypes affect severity of carotid artery atherosclerotic lesions, but the effect may not be mediated entirely by changes of serum cholesterol. ε4 allel is a risk factor.

　　【Key words】　apolipoproteins E　　gene　　coronary disease

　　冠心病（CHD）是由遗传因素及环境因素共同决定的疾病。血脂代谢异常尤其是低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）增高与CHD的关系最为密切。载脂蛋白E（apoE）是多种脂蛋白的重要结构及功能蛋白质，具有三种异构体（E2，E3，E4），分别由第19号染色体上的三种等位基因（ε2，ε3，ε4）编码。一些研究表明，apoE基因多态性是决定血脂水平进而影响CHD及动脉粥样硬化病变发生、发展的遗传因素之一，但存在明显的种族差异，结论尚不统一。本研究的目的在于探讨apoE基因多态性对中国人血脂水平的影响及与CHD发病及颈动脉粥样硬化程度的关系。

资料与方法

　　一、研究对象

　　1.CHD组：共96例于1995年10月～1996年6月收住我院心内科治疗的冠心病患者，男74例，女22例；年龄42～70岁（平均59.3岁）。均符合1979年世界卫生组织（WHO）的诊断标准。

　　2.对照组：131例，男102例，女29例；年龄40～68岁（平均58.1岁）。无冠心病的症状、体征，常规心电图及超声心动图检查无异常。次极量心电图运动负荷试验（Bruce方案）阴性。

　　以上研究对象均除外家族性高胆固醇血症；无糖尿病及肾脏、甲状腺功能异常；近3个月未用调血脂药。

　　二、血脂测定

　　血标本采集后，于30分钟内分离血清，置-70℃冻存，1个月内测定血脂。血脂测定方法： （1）甘油三酯（TG）：磷酸甘油氧化酶法及Trinder反应显色。 （2）总胆固醇（TC）：胆固醇氧化酶法。（3）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）：磷钨酸镁沉淀法及酶法。（4）LDL-C：采用Friedewald公式计算：LDL-C=TC-HDL-C-1/5TG（式中各项指标的单位均为mg/dl，TG＜400mg/dl时此公式适用。以上测定均使用同一台日本产AU-5031 Olympus全自动生化分析仪在本实验室最佳条件下进行，质控合格 。以上血脂指标的批间变异系数分别为：TC≤2.6%，TG≤2.2%，HDL-C≤5.3%）。

　　三、apoE基因型分析

　　提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）扩增apoE的基因片段，引物序列参照文献^［1］。PCR反应体系包括：1μg基因组DNA，200μmol/L的dNTPs,1pmol/μl的引物，10x反应缓冲液 (含Mg²⁺)，10％二甲基亚砜及1u TaqDNA聚合酶。总体积为30μl，以30μl液体石蜡覆盖。PCR程序：95℃预变性5分钟后进入循环，每个循环为：变性95℃1分钟－退火60℃2分钟－延伸72℃2分钟，经30个循环后延伸72℃10分钟，终止反应。PCR反应结束后，取5μl扩增产物进行2％琼脂糖电泳鉴定。取成功扩增的PCR产物20μl，加入5μHhaI酶及2μl 10x反应缓冲液,混匀后37℃酶切反应4～5小时，再进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，以银染法显示结果。

　　四、颈动脉内中膜厚度测定

　　CHD组52例男性患者进行颈动脉超声检查及内中膜厚度测定，方法参照文献［2］。本研究测定双侧颈动脉以下四个部位的内中膜厚度：颈总动脉远端10mm、颈动脉分叉处，颈内及颈外动脉近端10mm，测量远离皮肤侧的管壁。取双侧颈动脉共8个部位的平均值反映个体颈动脉增厚程度。颈动脉内中膜厚度的定义：管腔内膜界面与中层外膜界面之间的距离。由专人使用同一台超声诊断仪（Diasonics VMS彩色多普勒血流显象仪，探头频率7.5-10兆赫）测定。

　　五、统计学处理

　　计量资料采用非配对t检验、协方差分析及方差分析；计数资料采用卡方检验。计量资料表示方法：均数±标准差（x±s）。采用SAS（statistical analysis system）软件进行统计处理。

结果

　　一、CHD组与对照组一般资料及空腹血脂指标对比

　　CHD组与对照组相比，年龄、性别、体质指数（BMI）差异均无显著性（P＞0.05）。除女性HDL-C在CHD组与对照组之间无显著差异外，其余血脂指标在CHD组与对照组之间均差异有显著性（P＜0.05 ）（表1）。

　　二、载脂蛋白E基因型

　　227例受试者（CHD组96例，对照组131例）的apoE基因片段均得到满意扩增，片段大小为244bp。由于第112位和158位脱氧核糖核苷酸不同，经HhaI限制性酶切反应后产生不同的片段，由此区分为3种等位基因及6种基因型，本研究发现了全部6种基因型。CHD组及对照组均以E3/3型最常见，E3/4型次之，两组对比各基因型频率均无显著差异（P＞0.05）。根据apoE基因型频率及apoE基因复等位共显性特点，按Hardy-Weinberg平衡定律计算两组apoE 3种等位基因频率，显示CHD组ε2，ε3，ε4频率分别为7.3%,82.8%,9.9%;对照组分别为7.6%,83.6%,8.3%,两组间差异无显著性（P＞0.05）（表2）。

　　三、不同apoE基因型血脂水平对比

　　为研究ε4及ε2等位基因对血脂的纯影响，将ε2/4型剔除。并分别将CHD组及对照组按不同基因型分为三组：ε3/3, ε2/2+ε2/3, ε3/4+ε4/4。

　　1.病例组不同apoE基因型血脂对比： 在男性CHD患者，不同的apoE基因型间TC、LDL-C、TG均有显著性差异，其中TC、LDL-C按ε2/2+ε2/3,ε3/3, ε3/4+ε4/4顺序递增；TG在ε2/2+ε2/3组显著大于其它两组，女性有相似变化趋势，但无统计学显著意义。将男、女合并分析，显示不同apoE基因型间LDL-C及TG差异仍有显著性（表3）。

　　2.对照组不同apoE基因型血脂对比：在男性健康对照者，不同的apoE基因型间TC、LDL-C差异有显著性，按ε2/2+ε2/3,ε3/3, ε3/4+ε4/4顺序递增；女性虽有相似变化，但无统计学显著意义。将男、女合并分析，显示相同的结果（表4）。

　　四、男性CHD患者颈动脉粥样硬化与apoE基因多态性的关系

表1　病例组与对照组血脂水平比较（x±s）

　　 表2　病例组与对照组基因型及等位基因频率

　　 表3　病例组血脂水平与基因型之间的关系（mmol/L, x±s）

　　表4　对照组血脂水平与基因型之间的关系（mmol/L, x±s）

　　 表5　男性CHD患者不同基因型间颈动脉超声检查结果（x±s）

　　注：以LDL-C作为共变量进行协方差分析仍显示有显著差异；多发斑块：指超声显示两处以上狭窄斑块　　上述结果显示，apoE基因变异仅对男性患者血脂影响显著，且因仅1例含ε4等位基因的女性患者进行了颈动脉超声检查，故该项分析仅涉及男性资料。共有52例男性CHD患者进行了颈动脉超声检查，按apoE基因型分为3组：ε2/2+ε2/3,ε3/3, ε3/4+ε4/4, 3组间年龄、BMI及吸烟率差异无显著性，颈动脉内中膜厚度在不同基因型间差异有显著性，ε3/4+ε4/4组显著增加（P＜0.01），颈动脉多发斑块发生率在ε3/4+ε4/4组也显著增加（P＜0.05）（表5）。

讨论

　　apoE基因变异与CHD发病遗传易感性的关系是近年来临床及流行病学研究的焦点。不同人群apoE基因的分布频率各异^［3,4］，本研究显示，健康人ε2，ε3，ε4等位基因的相对频率分别为：0.076，0.836，0.088, 文献报道白种人上述3种等位基因频率分别为：0.08，0.77，0.15，本组受试对象ε3频率相对较高，ε4频率较低。Kuusi等^［5］研究发现，造影证实的CHD患者ε4等位基因频率较高，提示apoE基因多态性与CHD发病相关，但本研究未发现CHD患者与健康对照者间apoE基因型及等位基因频率有显著性差异，与近期国内有关报道相符^［6］，本研究显示CHD患者与健康人相比血浆TC、LDL-C浓度显著增高，进一步支持这些脂质异常是CHD的危险因素。影响血浆胆固醇水平的遗传因素是多方面的，最重要的是LDL受体的结构、功能及数量与细胞内胆固醇合成的限速酶HMG.COA还原酶的功能状态。许多研究发现apoE基因多态性是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一，可解释14％～17％血浆胆固醇浓度变异^［7］。本研究显示CHD组及对照组血清TC、LDL-C浓度与apoE基因型显著相关，其高低顺序为：ε2/2+ε2/3＜ε3/3＜ ε3/4+ε4/4，与以往多数研究结果一致。此外，在病例组血清TG水平在不同基因型间也有显著差异，其中ε2/2+ε2/3组显著大于其它两组。由于女性例数少，故虽有相同的变化趋势，但未达统计显著水平。Lehtinen等^［8］的研究提示，apoE基因变异影响血脂的作用存在性别间的差异，但应扩大样本量进一步探讨。

　　采用高分辨二维超声扫描法测定颈动脉内中膜厚度以监测动脉粥样硬化改变过程 ， 已广泛地用于流行病学及临床研究。研究表明该指标不仅是广泛动脉粥样硬化病变发生的早期标志，还能反映病变的严重程度及治疗干预后的消长状况^［9］。本研究发现含ε4等位基因的男性CHD患者颈动脉内中膜厚度较其他基因型者显著增加，且多发粥样硬化斑块的发生率按ε2/2+ε2/3＜ ε3/3＜ε3/4+ε4/4顺序递增，提示apoE基因多态性是影响动脉粥样硬化进展的遗传因素之一。通过影响血清TC，尤其是LDL-C的水平而间接影响动脉粥样硬化改变过程可能是部分机制，但本研究显示，排除LDL-C的干扰后，ε3/4+ε4/4型颈动脉内中膜厚度仍显著大于ε3/3型，提示apoE基因多态性对动脉粥样硬化过程的影响不完全是通过改变TC及LDL-C而介导的，还可能有其他机制参与。

　　本研究显示，apoE基因多态性与颈动脉粥样硬化有关，而与冠心病发病无关，可能与作为计量资料的颈动脉内中膜厚度是反映动脉粥样硬化病变更敏感的指标有关，此外，还受样本量影响。总之，apoE基因多态性是决定血脂水平，尤其是血清TC及LDL-C的遗传因素之一，并且在一定程度上影响动脉粥样硬化病变的进程，但apoE基因多态性是否为冠心病的独立危险因素，尚有待大系列前瞻性研究证实。

参考文献

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　　3　Eggertsen G, Tegelman R, Ericsson S, et al.Apolipoprotein E polymorphism in a healthy Swedish population:variation of allele frequency with age and relation to serum lipid concentrations.Clin Chem,1993,39:2125-2129.

　　4　Kao JT, Tsai KS, Chang CJ, et al. The effects of apolipoprotein E polymorphism on the distribution of lipids and lipoprotein in the Chinese population.Atherosclerosis,1995,144:55-59.

　　5　Kuusi T, Nieminen MS, Ehnholm C, et al.Apolipoprotein E polymorphism and coronary artery disease-increased prevalence of apolipoprotein E4 in angiographically verified coronary patients.Arteriosclerosis,1989,9:237-241.

　　6　朱大明，陈在嘉，曾武威，等.载脂蛋白E多态性与冠心病关系的研究.中国循环杂志，1997，12：347－350.

　　7　Siest G, Pillot T, Regis-Bailly A, et al. Apolipoprotein E:An important gene and protein to follow in laboratory medicine.Clin Chem,1995,41:1068-1086.

　　8　Lehtinen S, Lehtimaki T,Sisto T,et al.Apolipoprotein E polymorphism,serum lipid,myocardial infarction and severity of angiographically verified artery disease in man and women.Atherosclerosis,1995,114:83-91.

　　9　Bonithon-Kopp C, Touboul PJ, Berr C, et al. Relation of intima- media thickness to atherosclerotic plaques in cortid arteries. The Vascular Aging(EVA) Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol ,1996,16:310-316.

(收稿：1998-01-24　　修回：1998-05-07)