幽门螺杆菌长期保存后染色体DNA酶切图谱的分析

幽门螺杆菌是近年来从人体胃组织中发现的一种细菌，与胃和胃溃疡的发生有密切关系，而空肠弯曲菌则是近十年来国内外学者较为注意的腹泻致病菌，这两种细菌营养要求及培养条件均较高，特别在菌株保存方面，至今还存在不少问题，为了更好地开展这些疾病的基础研究，我们对不同种类的弯曲菌，在20%小牛血清布氏肉汤和全羊血中保存，于不同时间检查了存活情况、生物学特性及染色体DNA的酶切图谱，实验证明，用这种方法保存，在存活率、菌体形态、生物特性保持较好，染色体DNA酶切带型前后保持一致。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌自各型胃病患者的胃粘膜中分离，共15株。空肠弯曲菌由国内不同地区分离，共34株（其中人源菌11株，鸡源菌8株，鸭源菌6株，鹅源菌4株、猪源菌2株、羊源菌3株），另外从比利时引进空肠弯曲菌3株（Cj22，32，26），结肠弯曲菌2株（Cc25，29）及海鸥弯曲菌3株（Cl34，35，36）和分子量测定用经过HindⅢ酶解的标准γ噬菌体DNA。

1.2培养基 试验用培养基用改良布氏琼脂及布氏肉汤均按参考文献配制。

1.3 染色体DNA提取 弯曲菌经37°C48h在混合气体（10%CO2，5%O2，85%N2）条件下培养，每个平皿20mlT.E洗菌，置30ml的离心管，经5000rpm/分离心10min，弃上清，沉淀用10mlT.E悬浮，加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h；用酚抽提3次，酚/氯仿异戊醇抽提5次以上，再用氯仿抽提2次；然后透析）T.Hp8.0)24h以上，换T.E4次，用玻棒缠绕经异丙醇沉淀的DNA，再用75%乙醇浸泡2次，每次10min，将坡棒倒插，DNA向上，室温中凉干；用800μlT.E将玻棒上的DNA洗入小离心管中，于-20°C中保存。

1.4 弯曲菌染色体DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五种酶进行试验，各种酶均购自中国医学科学院基础医学研究所。

2 结果

2.1 过氧化氢酶阳性弯曲菌的生物学特性

对于-70°C条件下保存不同时间的弯曲菌主要生物学生物学特性：生长温度，1%甘氨酸的生长，对萘啶酮酸敏感性，尿素酶活必以及马尿酸水解，进行了检查与比较，基本特性与初分离时相同，其结果见表1。

表1 过氧化氢酶阳性弯曲菌经-70°C保存后生物学特性

以上结果表明在-70C条件下保存，弯曲菌复苏快，性状稳定。

2.2 弯曲菌于低温（-70°C）条件下存活检查

各种弯曲菌在布氏血琼脂中，经10代以目上传代稳定后，一般在混合气体条件下，于37°C经24h～48h培养后，均能见到较为丰富的生长，经涂片作0.3%复红单染色，镜检一般均能见到生长典型的弯曲菌，然后用Eppendorff离心管加1ml20%小牛血清布氏肉汤（或全羊血），将培养物用白金耳直接刮到小管内，形成浓厚的菌液，以后将小管在-20°C中预冻，次日再保存在-70°C中，经不同时间检查存活情况，结果如表2。可见在3～10个月内于-70°C条件下，全部存活，以上保存方法简便，易行，可作为弯曲菌保存。

表2 各种弯曲菌经-70°C低温保存后检查

2.3 经传代冷冻保存后，弯曲菌染色体DNA酶切图谱检测

2.3.1 空肠弯曲菌染色体DNA酶切 实验分两步进行 ①取空肠弯曲菌E3、E4（鹅源菌），G891（鸡源菌），流羊27（羊源菌）的染色体DNA，分别用三种内切酶进行消解（HindⅢ、PstⅠXbaⅠ）各管于37°C水浴中，作用1.5h，然后进行电泳，电泳在稳压下进行，电压为50V，电泳完毕后将琼脂糖凝胶（E.B加在凝胶中）置紫外灯下观察，并照像。②经初步试验后，又取适宜的PstⅠ进行消解，获得前后对比较好的结果。

2.3.2 幽门螺杆菌染色体DNA酶切 幽门螺杆菌自三种不同胃病患者的胃粘膜中分离，Cp397（慢性胃炎、溃疡病），Cp400（十二脂肠球溃疡），Cp407（浅表萎缩性胃炎），提取染色体DNA后，用Bg1Ⅱ进行酶解，各管于37°C水浴中，作用2.5h电泳40V.2h后30V17h，电泳后将琼脂糖凝胶（E.B加在凝胶中）置紫外灯下观察照像。可以看出用HindⅢPstⅠey XbaⅠ对不同弯曲菌酶切图谱有所不同，但其中以PstⅠ酶切的带型较清晰，还可看到四株不同来源的空肠弯曲菌及三株幽门螺杆菌，在较为长期保存后，染色体DNA酶切图谱带型完全一致。

3 讨论

弯曲菌菌种保存，对于深入开展对本菌的研究，有着非常重要的意义，文献上介绍的方法不多，幽门螺杆菌用全血或加20%小牛血清布氏汤或加入各种添加剂进行保存，但时间均不太长，Drum等用10%小牛血清布氏汤液体培养物，经24h培养后，添加50%甘油及小牛血清，于-70°C中能存活6个月；空肠弯曲菌用50%卵黄盐水，使用时，接种一白金耳菌苔，置微氧罐内，增殖24h，换上橡皮塞，置35°C温箱中，可保存5个月之久，在布氏肉汤内于-20°C中可存活2个月；15%甘油布氏肉汤中，在-70°C中可存活半年，但以上方法所保存的菌株，均不能获得完全存活；而我们所用的10%的小牛血清布氏肉汤，将24h～48h的新鲜菌苔，直接刮到保存的Eppendorff离心小管中，每管加培养基1ml，不需重新培养，可直接置-20°C中预冻，过夜后，再于-70°C中作长期保存，细菌染色体DNA限制性内切酶分析，可应用于流行病学调查及菌型的鉴定，同型的菌株应该有完全相同的染色体DNA酶谱；实验证明经这种方法对弯曲菌保存后、其生物学特性及染色体DNA酶切图谱的检查，均获得性状的前后一致，因此，这是一种比较简易可行的保藏方法，但对更为长期的保存，仍需作进一步的研究