第四节　动脉血管壁免疫化学鉴定方法

　　免疫化学方法是利用抗原与其相应抗体具有特异结合的特性，用荧光素、酶、发光素、同位素、胶体金标记某种抗原的抗体，借助荧光显微镜、电镜、图像分析仪、同位素监测仪、分光光度仪便可对组织中的抗原进行定性或定量，可用于胶原、蛋白多糖、弹性蛋白、粘连蛋白、血浆成分的定位和定量分析。

　　1．抗原提取及单克隆抗体的制备（从略）。

　　2．抗体的标记：基本原理是将抗体与标记物以共价键结合。

　　3．组织取材。

　　因为抗原组织容易降解和扩散，取材要及时和低温操作，取动脉壁冰冻切成4～8μm，贴于玻片上立即干燥，用95%乙醇固定15min，然后用0.5mol/l pH7.4 BPS洗1次。

　　4．抗体染色

　　抗体染色是利用抗原与抗体特异性结合的原理，37℃30～60min，间接法结合第二抗体，37℃ 30～60min。每步间隔都用PBS pH7.4洗涤5～10min共洗3次。抗体染色方法有直接法、间接法、补体法：

　　（1）直接法：标记抗体直接于组织中进行抗原结合反应，用于鉴定未知抗原。

　　优点：①结果判定简单；②特异性强，因反应过程中只有两个因素，与抗原交叉反应较少。

　　缺点：①不能鉴定未知抗原；②一种标记抗体只能检测一种抗原；③敏感性差。

　　（2）用已知未标记抗体与未知抗原相互结合或用未知抗体与已知抗原相互结合，一定时间后洗掉未结合成分，加第二标记的抗体。若第一步反应中有Ag-Ab的特异结合，才会有第二步后续反应。

　　优点：①既能检查Ag又能检查Ab；②标记一种抗体，就能与一种以上的相应抗原结合鉴定多种抗原或抗体；③敏感性比直接法高。

　　缺点：①参加反应因素多，易出现非特异性反应；②实验方法复杂。

　　（3）补体结合法：是标记补体抗体的方法，第一步是将抗体和补体加入反应体系；第二步是加入标记补体抗体，若第一步有Ag-Ab反应，补体抗体则可结合于补体上。

　　4．染色定性定量分析

　　荧光素标记抗体可用荧光显微镜作定性分析。用显微荧光分光光度计可定量。酶标抗体可用普通显微镜定性，也可定量。放射性同位素和发光素标记可用同位素检测仪和发光计作定性、定量分析。

（孙续国）

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