第四节 ICC的几种特殊应用
近年 ICC技术在下述方面的应用，令人注目，有着广阔的前景。现介绍如下：
一、ICC在铺片中应用
铺片（Whole Mount Stretch Preparation） 是研究神经分布应用较早、较广的方法。19世纪末，Dogiel和Cajal等利用铺片技术，结合镀银及甲基蓝染色，观察肠道神经丛模式、神经元种类及其相关联的间质细胞。近年来，人们进一步认识到全层铺片技术的优点：例如①不必采用连续切片和三维重建技术，可以直接观察神经元间质细胞的三维结构；②能观察较大区域，在研究显微外科手术后神经分布模式和数量改变中有较好的应用价值；③操作简单，能在较短时间内制作大量标本等。所以，铺片技术在ICC染色中得到广泛的采用（Zhou等1992）
铺片ICC染色方法与切片基本相同，所不同的是铺片较厚，背景着色较强，有时甚至妨碍特异性染色的观察。实验证明，这种非特异性染色主要是酶标抗体/桥抗体与组织γ-球蛋白结合引起的，用封闭性阻断剂及正常血清等分别孵育切片，并在稀释抗体时，加入适量的BSA，可以降低此类非特异性结合。BSA、封闭性阻断剂与IgG（正常血清）的等电点不同，重叠应用，阻断效果尤佳。另外，铺片的细胞膜完整，不利于抗体的穿透，特别是PAP复合物等大分子物质，为此设法提高抗体的穿透性是非常重要的。采用反复冻融和表面活性剂前处理，有助于细胞内抗原的暴露。我们在实验中参考Costa(1980)的制片方法，将组织铺片经系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min）脱水，Hemo—d 2次（10～15in/次），再水化（100%、90%、70%、50%降酒精）等处理，辅助Triton X-100应用，明显增加抗体的穿透性，获得较为满意的染色效果。 但是，并非所有的组织都能制成铺片，虹膜、肠系膜和小血管等适于制做全层铺片；食道、胃肠道、胆道、胆囊、大血管、输尿管等脏器则均需进行组织分层，再铺片，行ICC染色。
染色方法：以小肠分层铺片为例：
（1）4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。
（2）PBS充分冲洗，置PBS中过夜。
（3）系列酒精脱水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。
（4）分层铺片，直接漂浮染色或贴于载玻片风干，再染色。
（5）0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室温，PBS冲洗。
（6）封闭性阻断剂30in，室温，正常兔（羊）血清30min，室温。
（7）第一抗体，孵育，4℃冰箱过夜；PBS2次/2min；重复第一抗体孵育（可稀释1
倍），2～3h，室温，充分使抗体穿透至深层，使组织深层的抗原得以与抗体充分结合。
（8）PBS充分冲洗，2～3h，4℃。
（9）酶标抗体孵育，4℃冰箱过夜。
（10）PBS冲洗，呈色，观察与切片相同。
二、ICC的双重染色法
在某些物质活性检测、神经递质共存的研究、临床肿瘤的分型、定性，以及预后的估测等中，ICC显示了巨大的优势，它不仅能与Carbon、荧光色素、同位素追踪标记及其它组织化学方法（例如PAS染色法）结合，显示两种物质的共存，提示组织细胞的功能，而且本身亦可进行双重染色，研究一些抗原物质的共存，这里仅简单介绍ICC双重染色的几种方法。
（一）切片
1．连续切片（Serial sectioning technique） 连续切片是两种物质共存研究中应用最早的方法之一，是用相邻切片分别孵育两种不同特异性抗体进行ICC染色，主要适用于观察同一细胞内不同抗原的分布。该方法要求切片足够薄，保证每个细胞能同时出现在3～4张相邻切片上，第1和3张切片用相同抗体染色均阳性时，作为阳性结果，可信度较高，可避免结果判断困难。所以，常采用石蜡切片，厚约2μm左右，若用树脂包埋的半薄切片（0.5～1μm），比较容易识别同一细胞内两种抗原的共存。
2．镜影切片法（Mirror sectioning technique） 所谓镜影切片，简单地讲就是两张相邻的石蜡切片（厚2μm）或冰冻切片（厚3～4μm），第二张反转之，贴于载玻片上，同一细胞在两张相邻的切片上呈镜与影的关系（相当于冰冻蚀刻电镜的P面和E面）。分别孵育两种不同抗体，ICC染色，观察其在同一细胞内的分布。
（二）染色
1．ICC与荧光抗体法结合 首先染色显示A抗原，DAB/H2O2呈色，继之用间接（直接）荧光抗体法显示B抗原，于光镜和荧光显微镜下观察，比较两种抗原的分布。因DAB终产物能够沿其表面向周围迁移，尤其是DAB浓度略高、反应时间稍长时，形成的终产物较大，可以遮盖该抗原抗体的反应部位，故两种染色间很少出现交叉反应。该双重染色的方法主要适于显示两种抗原分布不同细胞内，尤其A抗原浓度高、反应较强、DAB终产物较牢固的情况。
2．同一切片的再度染色法（Restanining Method） 用ICC法显示神经递质、神经肽等在神经细胞/神经纤维内共存时，连续切片、镜影切片及重叠染色往往很难判断同一神经纤维的共染，为此建立了同一切片再度染色法。该方法利用4—氯—1—萘酚（CN）产物在酒精内的可溶性及酸处理能使抗原抗体解离的特点，首先第一种抗原用CN发色，染色阳性部位摄影；继之，用低 pH的甘氨酸/盐酸缓冲液（0.2mol/L甘氨酸—盐酸缓冲液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl）或盐酸孵育切片，去除第一次染色的抗体，再经50%、70%、90%、100%酒精脱CN色，PBS洗净后染色第二种抗原，DAB呈色后，摄影比较同一部位是否两种抗原共存在于同一神经纤维。为验证盐酸等处理效果，可省略第二次染色的特异性抗体，仅重复酶标抗体的染色，观察第一抗原阳性部位是否出现重叠着色。
3．同一切片、不同呈色的双重染色ICC法显示A抗原时，用DAB/H2O2呈色，终产物为棕褐色；继之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反应产物深蓝色，光镜下可同时观察两种抗原的局部所在。为避免第二次染色的抗体与第一次染色抗体之间的交叉反应，在B抗原染色前，可用酸性缓冲液处理切片，去除第一次反应的抗体，方法同2。该方法DAB和CN的色彩对比不鲜明，而且HRP酶活性较强，酸性缓冲液中，亦能残存部位活性，所以可能有混合颜色出现，判定同一细胞内两种抗原共存常常有一定难度。
4．两种酶标抗体的双重染色 分别用HRP和ALP标记间接抗体，ICC染色，显示两种不同的抗原。首先显示A抗原，HRP酶标记间接抗体，CN/H2O2呈色；继之显示B抗原，ALP标记间接抗体，FR/As—Mx呈色，轻度甲基绿/苏木精复染细胞核，一般可获得理想的结果，组织结构清晰，色彩对比鲜明。笔者应用此方法，显示小鼠脾脏巨噬细胞标记物ED1、ED2和ED3分布时，得到了较佳的染色效果。尽管该双重染色法应用了不同的酶标抗体，但常用其二者来自同一种属的抗体，所以在第一次染色部位，往往有重叠染色的现象。我们的经验为先染色反应较弱、含量较少的抗原，第一抗体用较高稀释度，酶标抗体则用高浓度（低稀释度），尽量使所有的第一抗体均被饱和，防止其与第二种酶标抗体结合；第二种抗体染色前，应用PBS充分洗净；第二种酶标抗体可用较高的稀释度。这样可避免“非特异”性重叠着色，色彩对比亦较理想。
5．不同种属来源的抗体的双重染色 上述几种双重染色法，均系来自同一种属的特异抗体和相同/不同的酶标抗体，所以两次染色间常常有交叉反应。较理想的方法是用不同种属动物制备特异性抗体和两种酶标抗体的双重染色，例如显示A抗原为小鼠单克隆抗体，HRP标记兔抗鼠IgG；显示B抗原为豚鼠单克隆抗体，ALP标记羊（驴）抗豚鼠IgG ，将两种抗体稀释最佳工作液浓度1/2，充分混合、孵育同一张切片，亦可分别染色。CN/H2O2呈色后，FR—As—Mx呈色，光镜下观察两种抗原的分布。该方法两种抗体间无交叉反应，特异性较高，即使细胞内抗原量较少也能发现。但当两种抗原存在同一部位，其中之一浓度较高、占绝对优势时，亦将妨碍另一种抗原的染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。该方法要分别制备4种不同的特异性抗体和酶标抗体，费时费力，实际应用受一定限制。
上述两种双重染色，两种酶标抗体的非特异性着色可能迭加，致使背景着色较单独使用时增强，S/N下降，所以各研究室应根据实验目的和条件，合理选择染色方法为宜。简述染色步骤如下：
（1）切片准备同一般间接法。
（2）切片孵育A抗原，特异抗体1～2h室温。
（3）PBS冲洗，孵育HRP标记抗体45min，室温。
（4）PBS冲洗，孵育B抗原的特异抗体1～2h，室温。充分漂洗，孵育ALP标记抗体，45～60min。
（5）PBS冲洗，Baker’液固定5min，室温，PBS洗净。
（6）呈色CN/H2O2/TBS 15min，室温。
（7）Tris—HCl(pH9.0)冲洗后，Fr AS—Mx呈色8min,37℃。
（8）轻度PBS冲洗，1%戊二 醛固定5min。
（9）水洗，轻度复染细胞核，水溶性封固剂封片。
（10）光镜下观察。双重标记细胞呈暗红至深紫色，与单独阳性细胞有明显区别。
三、ICC在细胞功能研究中的应用
形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用ICC显示给与细胞增殖标记物，是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有4种，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNA polymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相对应的4种单克隆抗体均有商品出售。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广。Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g体重，分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠，应用抗Brdu抗体，ICC染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射Brdu后，计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu，计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。
掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。
盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。简述染色步骤如下（Matsuna,1989）：
（1）冰冻切片/石蜡切片准备同前。
（2）TBS冲洗，Baker’s液固定10min，室温。
（3）TBS冲洗，1%戊二醛固定5～10min，室温。
（4）双蒸水冲洗，0.006%(冰冻切片)或0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
（5）双蒸水冲洗，4N HCl 30min，室温。
（6）PBS充分冲洗，使切片pH回至中性。
（7）封闭性阻断剂20min，室温。
（8）抗Brdu抗体孵育1～2h室温或4℃过夜。
（9）PBS冲洗，HRP标记抗小鼠IgG抗体45min，室温。
（10）PBS冲洗，DAB/H2O2呈色。
（11）轻度苏木精复染，脱水透明，封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。
采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复上述程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。
四、 ICC在原位杂交技术中的应用
传统的ICC法主要用于检测组织细胞中含有何种物质，根据该物质的作用，推测其组织细胞生理、病理意义。但该物质来自何处，是否是阳性细胞合成往往较难判断，结合免疫电镜及双重染色等方法，在某种程度上，有助于推断该物质的来源。然而通常ICC法显示的是组织细胞已经合成的物质（过去时），本身不能说明阳性组织细胞目前的功能状态，亦无法预测细胞将合成何种物质，发挥什么功能，因此，单纯的ICC法存在着被动性。
近年来，ICC法与原位杂交技术结合，使细胞内活性DNA可视化，直接显示某染色体上，何种基因活性化或非活性化，描述组织细胞现在的状态，同时亦可预知未来组织细胞将合成何种物质，发挥哪些功能等，直接观察组织细胞的时空改变，这在病理生理研究中有着重要意义，为形态学研究开辟了令人瞩目的前景。
众所周知，机体内不同的蛋白质发挥其特定的功能，与其氨基酸序列密切相关，而它的氨基酸序列又是DNA通过mRNA转录控制的。因此检测该DAN/mRNA的分布，可判断组织细胞的功能状态。为在组织细胞水平检测DNA/mRNA等一定碱基序列的核酸存在与否，Gall（1969）等建立了原位杂交方法（详见第二十章 ）。
在检测某种特定的蛋白质在哪一类细胞内合成时，常常应用连续切片或镜影切片，原位杂交法显示合成该蛋白质的mRNA，ICC法染色其蛋白质抗原，二者存在于同一细胞时，具有较强的说服力。同一切片进行上述双重染色时，原位杂交步骤中，大多数抗原物质的抗原性往往易被破坏，所以最好在ICC染色后再进行原位杂交染色。ICC染色中，抗体内含有RNase等可能破坏细胞内的mRNA，为此应选用精制IgG抗体，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化学性质与核酸类似，能够与以核酸为底物的酶（RNase）结合，从而保护mRNA免受破坏。另外，ICC染色以DAB呈色时，核酸探针易吸附于DAB产物上，需注意。
近年随着细胞工程的进步，ICC、原位杂交技术将在细胞生物学、组织学、遗传学、病毒学、临床疾病诊断等各个领域，得到更广泛地应用。
参考文献
1.Bigbee JW,et al . Effects of primary antiserum dilution on staining of antlgen rich tissue with the peroxidase antiperoxidase technique. j Histochem Cytochem. 1977；25：433～447
2.Borrsma DM. Preparation of HRP Iabelled antibodies。In Cuello AC(ed) lmmunohistochemistry, John Wiley&,Sons, New York ：Bris－bane Toronto Singapore, 1983：87～100
3.Conchoroff NJ, et al . A monoclonal antibody reactive with 5—Boromo—2 deoxyuridine that does not requireDNA denaturation。Cytometry,1985；6t506～512
4.Costa M, et al. Immunohistochemical localization of polypeptides in peripheral autononic nerves using whole mount preparation, Histo－chemistry, 1980；65：157～165
5.Cumming R. Cyclic nucleotide losses during tissue processing for immunohistochemistry。j HistochemCotychem, 1980j28：54～55
6.Gall JG, Paudue M. Formation and detection of RNA—DNa hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natu Acad Sci USA, 1969：63,378～383
7.Grzanna R, Light microscopic immunocytochemistry with fixed unembedded tissue, In Bullock GR&Petrusz P·(eds.)Techniques in immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：183～204
8.Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined speciflcity, Nature,1975；256：495～497
9.Imagawa M, et al. Characteristic and evaluation of antibody horseradish peroxidase conjugates prepared by using maleimide compound,glutaraldehyde and periodate. J Biochem, 1982 j 4：41～57
10.Li CY, et al. Use of azide and hydroRen peroxide as an inhibitor for endogenous peroxidase in the immunoperoxidase method , J Histochem Cytochem, 1987；35： 1457～1640
11. Matsuno K, et al. Splenic outer periarterial lymphoid sheath (PALS)：An immunoproliferative microen- vironment constituted by antigen laden marginal metallophils and ED3 positive macrophages in the rat. Cell Tissue Res, 1989；257：459～470
12.Nakane PK, Pierce GB. Enzyme labelled antibodies：Preparation and application for the localization of antigens。j Histochem Cytochem, 1966；14：929～931
13.Norrden SV, Polak JM. Immunocytochemistry today techniques and practice, In Polak JM&Norrden SV(eds.) Immunocytdchemistry. London：Wright PSG Bristol, 1983：11～42
14. Oi VT, Herzenberg LA. Imrnunoglobulin producing hybrid cell lines. In Mishell BB and Shiigi SM, (eds.) Selected methods in cellular immunology, San Francisco：Freeman WH and Company, 1980：351～375
15. Sato Y, et al . The AMeX method. A simplified technique of tissue processing and paraffin embedding with improved preservation of antigens for immunostaining. Am J Pathol, 1986；125：431～435
16.Shi SR, et al . Antigen retrieval in forrnalin fixed,paraffin embedded tissue：An enhancement method for immunohisotchemical staining based on microwave oven heating of tissue sections 。j Histochem Cytochem, 1991；39：741～748
17.Sternberger LA, et al . The unlabelled antibody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen –antigody complex (horseradish peroxidse antihorseradish peroxidase ) and its use in the identification spirochetes, J Hsitochem Cytochem, 1970；18：315～333
18. Sternberger LA, Immunocytochemistry。New York：John Wiley&Sons, 1979
19.Sternberger LA, Conjugated antibody method. In ：Sternberger LA(ed) Immunocytochemistry。3rd edi—tion, New Yor ：John Wiley&Sons, 1986
20. Vacca LL. Double bridge technique of immunocytochemistry.In：Bullock GR&Petrusz P. (eds,) Tech. niques in Immunocytochemistry. London：Academic Press inc, 1982；1：155～182
21. Yasuda K, et al. Application of ultrasound for fixation：Combined use with microwave to enhance the effect of chemical fixation. Acta Histochem Cytochem, 1992；25： 237～244
22. Zhou DS, Komuro T. Interstitial cells associated with the deep muscular plexus of the guinea—pig small intestine, with special reference to the interstitial cells of Cajal. Cell Tissue Res, 1992；268： 205～216
(周德山）