第七章　电子显微镜免疫细胞化学技术

第一节　电子显微镜免疫细胞化学技术概述

　　免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学分辨率的限制，不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。因此，Singer于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白（ferritin）标记抗体的方法，为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫细胞化学技术（以下简称免疫电镜技术技术）区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：

　　一、组织固定与取材

　　在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。因此，选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde简称PLP液）。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法见附录）。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择性地使糖类固定，就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

　　二、免疫染色

　　分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

　　1．包埋前染色 　即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构往往保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片，寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验，半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察（指PAP染色法），免疫反应部位呈黑点状。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片，可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，可取相连续的起薄切片，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

　　包埋前染色法的优点是：①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。

　　2．包埋后染色 　组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又名之载网染色（on grid staining）。必须指出的是：①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见，作者经验一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为，从理论上讲，四氧化锇具有保存抗原的作用，但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性，还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此，免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂，取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前，以H2O2液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。

　　3．超薄冰冻切片　　按照Tokuyasu建立的方法，将组织置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速冻，在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。

　　三、包埋

　　（一）树脂包埋

　　国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。

　　（二）低温包埋

　　常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代，80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA）,Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下：

　　1．Lowicryls 是丙烯酸盐（acrylate） 和甲基丙烯酸盐（methacrylate）化学物质，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品（Polysciences INC），其特点是能在低温下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波长360nm）下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多，现侧重介绍如下：

　　（1）包埋剂的配制：商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成：单体（Monomer），交联剂（Crosslinker）和引发剂（Initator）。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：

　　K4M：单体 　　17.30g

　　交联剂　　2.70g

　　引发剂　　0.10g

　　K11M：单体　　19.00g

　　交联剂　　1.00g

　　引发剂　　0.10g

　　作者的经验，可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒轻搅3～5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。

　　（2）生物样品处理程序（Lemanski 等1985）

　　①动物麻醉取材，以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。

　　②磷酸缓冲液含7%蔗糖，pH7.2,冲洗过夜，0℃

　　③0.1mol/L 磷酸缓冲液，pH7.2,冲洗，0℃

　　④脱水：65%乙醇，1h ,0℃

　　80%乙醇，2h,-35℃

　　Lowicryl K4M：80%乙醇=1：11h -35℃

　　Lowicryl K4M：80%乙醇=2：11h -35℃

　　100% Lowicryl K4M 1h -35℃

　　100% Lowicryl K4M 过夜-35℃

　　⑤包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距30～40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。

　　（3）免疫染色

　　①切片（厚50～70nm）贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm）滤过。

　　②正常羊血清30min。

　　③第一抗血清（PBS稀释），37℃2h。

　　④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法），以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡1h 。

　　⑤正常羊血清30min。

　　⑥第二抗血清（胶金标记抗体）以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育1h。

　　⑦冲洗如④。

　　⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。

　　⑨冲洗如④。

　　⑩干燥后在电镜下观察。

　　（4）Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984）

　　①包埋剂的配制：单 体13g

　　交联剂2g

　　引发剂75mg　

　　②生物样品处理：除了聚合这一步骤外，下列所有步骤都在20℃进行。

　　1）组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。

　　2）脱水：在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF）内系列脱水，每步10min。

　　3）浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2　 10min

　　Lowicryl K4M:DMF=1:1 　15min

　　100% Lowicryl K4M 　20min

　　100% Lowicryl K4M　 25min

　　4)包埋与聚合：组织移入装满K4M的胶囊中，以紫外线灯照射聚合（紫外线灯条件同上），灯和组织距离10cm,4℃照射45min，组织块在室温进行超薄切片（切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面）。

　　5）以覆有碳膜的镍网捞取切片。

　　6）免疫染色。

　　整个包埋时间仅需4～5h。

　　Lowicryls 应保存在暗处，-4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部，氧化重金属如KmnO4能与包埋剂作用而影响染色效果，以不用为佳。

　　2．LR White 和Lr gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂，具有极低的粘度（8cps）和较强的嗜水性，因此有较强的穿透性，有利于抗体（或抗原）和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜（半薄切片）和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70%乙醇即可，能较好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在国外提供厂家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一种光引发低发低温聚合的包埋剂，对于免疫细胞化学特别适用，能最大限度地保持组织的抗原与抗体活性，其最佳光聚合温度在-25℃，在聚合后呈现金黄色，因而得名。Lr white可在热和冷两种情况下聚合，热聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速剂（accelerator）调整配制比例。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。

　　3．GMA 　是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA）的缩写。远在60年代，电镜工作者就试图将其作为生物包埋剂应用于光镜和电镜。GMA作为电镜包埋剂的优点是电子密度大，影像反差好。但存在三个主要缺点：一是包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。二是聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。三是缺乏稳定性，不能承受电子束的轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而GMA包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者如Leduc和Bernhard（1986）尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入适量的增塑剂如聚乙二醇400（PEG400）以改变其硬度，加入适量的闻联剂乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate）以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构，选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide），温度范围-10℃～-30℃。经过不断的配制改进，现GMA已广泛应用于半薄切片（1～3μm）的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下：

　　（1）GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。

　　（2）包埋剂的配制：

　　a. 100% GMA　　　　　　　　　　66.5ml

　　N—甲基丙烯酸丁酯　　　　　　　28.5ml

　　5%乙烯二甲丙烯酸酯　　　　　　　5.0ml

　　1.5 %过氧体苯甲酰　　　　　　　1.0g

　　1.0%PEG 400　　　　　　　　　　1.0ml

　　b.A液：

　　GMA单体液　　　　　　　　　　 90ml

　　PEG 400　　　　　　　　　　　5～9.4ml

　　过氧化苯甲酰　　　　　　　　0.2～0.69g

　　搅拌溶解后置棕色瓶内；　　　4℃保存。

　　B液：

　　PEG 400　　　　　　　　　 20ml

　　二甲基苯胺　　　　　　　　1ml

　　应用时A：B按10：1比例充分混合（张承志等1986）。

　　（3）生物样品处理：组织固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸缓冲液配制，pH7.4）。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4℃进行。

　　（4）包埋聚合：组织移入盛潢包埋液的胶囊内，先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯（波长360nm）在距胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢入热水中以去除胶囊外壳。

　　（5）切片贴在镍网上，按PAg技术进行包埋染色，其区别于EPON包埋剂者，在于GMA包埋切片染色所需时间较短，在第一抗血清中，GMA室温只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 复合物中室温30min，而EPON包埋切片需1h。铀、铅双染后，电镜观察。

　　低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。

　　四、对照试验

　　为确定方法的特异性，免疫电镜技术也需进行对照试验（同第一章　）。

　　总之，不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾，如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响，而H2O2能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中，应同时注意到这两个方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底，否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应产物的显示和观察。根据作者经验，以塑料水壶加锥形喷水头喷洗，与镍网面成平行方向，即顺网面喷洗，较之目前通用的杯水洗涤法易于达到清洁目的。冲洗的残留水滴以滤纸吸干时，应注意不要触及载网本身。可将滤纸剪成三角形，以尖端接触水滴，即可达到吸干水份的目的，整个过程中，必须应用双蒸水，容器应专用。