第五节　放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本试剂

　　（一）标准品

　　标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

　　按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

　　（二）标记物

　　标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

　　要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用¹²⁵I时达5000～15000cpm。

　　（三）抗体

　　应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

　　根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

　　（四）B与F分离剂

　　以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）

　　右旋糖酐T₂₀0.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　电磁搅拌1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

　　（五）缓冲液

　　放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

　　目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris –HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

　　在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定cAMP、cGMP时，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白：采用二抗作B与F分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神经肽的RIA时，常用PELH缓冲液，（按1000ml,pH7.6）：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加样程序

　　由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

　　（一）平衡饱和加样程序

　　1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

　　2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

　　在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

　　以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：

　　（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）

　　（2）孵育：4℃，24h

　　（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

　　（二）顺序饱和加样程序

　　1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

　　应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

　　2．加样程序　以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

　　（1）加样（单位μl；总反应体积600μl）

　　（2）孵育：4^℃，24h。

　　（3）分离B与F。

　　无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

　　（三）计数、绘制标准曲线与测定样品含量

　　以活性炭分离B与F，沉淀计数是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm数。

　　计算标准管与样品管结合（B）的cpm数及与零标准管结合（B₀）的比（B/B₀×100%）。

　　用半对数纸，以标准管的B/B₀为纵座标，以各标准管含量为横座标，绘制标准曲线。

　　根据样品的结合率（B/B₀×100%），从标准曲线中找出被测样品抗原的含量，再换算成每毫升血浆含某抗原的量，或每毫克（组织湿重）含某抗原的量。

　　三、放射免疫分析的质量控制

　　（一）质量控制的目的和内容

　　放射免疫分析的质量控制实际上就是控制测定误差，监督测定结果。它包括两方面的内容：一方面对测定结果做精确分析；另一方面鉴定常规测定方法，对那些测定结果不好的方法加以改进，并建立新的测定方法。质量控制分四个方面：

　　1．在一个测定方法内产生的误差。

　　2．在同一实验室内不同方法之间产生的误差。

　　这两种情况属于内部质量控制。

　　3．用同一测定方法，在各实验室之间产生的误差。

　　4．采用不同方法，在各实验室之间产生的误差。

　　后两种情况属于外部质量控制。

　　（二）放射免疫分析中造成测量误差的因素

　　误差包括系统误差和随机误差。系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。

　　造成误差的可能来源有以下几个方面：

　　1．各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。如：①由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。②由于样品的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。③在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。④由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。

　　2．试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。如标记抗原的比度、纯度，辐射自分解，抗体的稳定性，分离剂、阻断剂及缓冲液等试剂的纯度等。

　　3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取样、提取、沉淀、分离以及保温条件不适当等造成的误差。由于工作人员熟练程度不同也常常带来误差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹气与不吹气等。工作人员草率、不按规程操作等也都可以造成误差。

　　4．样品误差。样品的收集方法、贮存温度、放置条件，微量样品取样的准确度，样品可能造成的污染以及样品的变性（如免疫反应活性的降低、蛋白质的变性等）也都能造成测量的误差。

　　5．提取及层析分离过程中的丢失。

　　（三）放射免疫分析中测量误差的控制

　　1．选择准确性高的方法：对各种方法进行比较，淘汰粗糙及难以重复的方法。

　　2．建立方法对比。用相同的测量方法和不同的测量方法在同一实验室和不同实验室，在同一地区和不同地区，在同一时间和不同时间，对同一样品进行对比，检查产生误差的原因。

　　3．建立各种类型的标准。对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮存条件。

　　4．建立操作规程，按章　操作。对使用的试剂、仪器设备要经常检查其有效性，更换试剂时应进行必要的鉴定，必要时对测定方法要做重复性试验和回收试验。

　　5．建立可靠的检查制度。经常对测定结果进行核查，利用控制血清、标准血清检查每批结果的准确性。

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　　(王成海)