第一节　免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围

　　在肾脏疾病时，免疫细胞化学技术主要应用于肾脏穿刺组织的检查，也可应用于血清或肾脏洗脱液及尿液的特殊检查，兹分述如下：

　　一、肾脏组织的检查

　　肾穿刺组织一般应切割为三小块，分别作冰冻切片、石蜡切片及超薄切片，进行荧光显微镜、光学显微镜及透射电镜观察。所应用的免疫细胞化学技术包括免疫荧光、免疫酶标及免疫电镜，兹分述如下：

　　（一）免疫荧光细胞化学技术的应用

　　自1938年超高压汞灯荧光显微镜问世后，Coon于1942年首先应用荧光素标记抗体检查肺炎球菌，为荧光抗体技术的发展奠定了基础。1961年Dixon开始在肾脏疾病中应用，对肾脏的免疫病理研究起了重要的推动应用，并逐渐成为在肾脏疾病的病理诊断中不可缺少的重要环节　。主要用于冰冻切片，具体操作技术如下：

　　1．切片及染色　　肾组织要求为未经任何处理的新鲜组织，应立即送入恒温冷冻切片机（cryostat）内，将肾组织放置于金属托上，周围添加OCt 　compound 包埋剂（如无包埋剂，滴加数滴生理盐水亦可），迅速冷冻至-20℃，切出3~5μm厚的冰冻切片附贴于载玻片上，至少需切10张以上备用。继而使用荧光素标记之各种抗体进行免疫荧光染色（具体操作步骤参见第三章　）。所使用之荧光标记抗体包括羊或兔抗人各种免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)、抗人补体各种成分（C1q、C4、C2、C3、C5、备用素、B因子等）以及抗人纤维蛋白元等，以期了解肾小球内有何种免疫球蛋白沉积、补体激活的途径和有无凝血机制启动。此外，目前尚有应用荧光标记之抗纤维连接蛋白（fibronectin）、抗层粘连蛋白（laminin）、抗α-纤溶酶抑制因子（α-PI）、抗纤溶酶原（P1q）等特殊抗体，以探讨研究各种肾小球肾炎时肾小球内纤维连接蛋白和层粘连蛋白分布情况的变化以及凝血和纤溶系统成分的变化。常使用之荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC，显绿色荧光）及异硫氰四乙基罗达明（Rodamine B-200，显橙红色荧光），对各种抗体进行标记。必须指出，每种荧光抗体只能检测一种相应抗原，因此必须准备多张冰冻切片，才能满足检查要求。一般在检查每一种抗原时，只能使一种相应抗体用荧光显微镜进行观察。如果同时需要检查二种抗原时，可同时使用FITC及RB-200标记的不同抗体进行双标记法观察。

　　2．荧光显微镜观察　　一般要求使用质量较高的荧光显微镜，最好使用落射光型，以提高在高倍镜观察时之清晰度，并应配备电子摄影装置，以便及时进行记录。进行荧光显微镜观察时，滤光片之配合使用十分重要。以常用之日本olympus荧光显微镜为例，观察FITC标记之抗体时，激发滤光片须使用RG-12，而压制滤光片应使用O-350，如观察RB-200标记之抗体时，激发滤光片须使用UG-1，而压制滤光片应使用R-610。观察时应做以下记录：①使用抗体的种类。②荧光显示的部位：如显示于肾小球毛细血管壁、系膜区、肾球囊壁、肾小管基底膜、间质血管壁及间质细胞等。③荧光显示的型式、：为连续线形、不连续颗粒状、团块状或短线状，不规则状等。④荧光显示的强度：可分为（—）荧光弱、（±）为荧光微弱、（+）为明确可见荧光、（++）为明亮荧光、（+++）为耀眼荧光。在特殊情况下可进行双重标记，即分别使用FITC标记和RB-200标记的两种不同抗体，在同一切片上进行染色，使用不同滤光片进行观察及摄影，以绿色荧光和橙红色荧光在同一张切片上显示两种抗原分布的部位。

　　3．荧光显微镜摄影技术　　使用荧光显微镜观察时，由于光源紫外线的照射，切片标本上抗原的荧光亮度常很快逐渐减弱，并可发生荧光淬灭现象；且免疫荧光染色的切片不能长期保存，因此必须立即及时进行显微摄影以记录所观察到的情况，以作为诊断根据和作为资料保存。摄影时一般应使用感光速度较快的彩色胶片，以160或400ASA为宜，才能保证拍摄出良好的荧光图像。必须指出的是，在标本的荧光强度不太明亮时，使用自动曝光摄影设备常不能取得良好的摄影效果。由于在摄影过程中，荧光强度逐渐减弱，照像机快门常长期不能关闭，以致影响摄影效果。因此，各个实验室应根据所使用的荧光显微镜的具体情况，以手动控制自动摸索适宜的摄影条件。一般应首先使用黑白胶片在低倍镜及高倍镜下对中等荧光亮度的标本以不同曝光时间进行摄影，根据底片曝光效果找出合适的曝光时间。待积累一定经验后再使用彩色胶片进行摄影。根据个人的经验，以Olympus落射光型荧光显微镜为例，中等荧光亮度的标本，使用160ASA彩色胶片，于低倍镜下摄影，曝光时间为1~2min即可，高倍镜下摄影时曝光时间需延长1倍。曝光时间适宜之彩色胶片，洗印后荧光呈绿色；如呈现黄色，即为曝光过度，应减少曝光时间。一般在荧光显微镜摄影时，最好应准备3个照像机暗盒，分别拍摄彩色正片（作幻灯片用）、彩色负片（作实验记录用）及黑白负片（供发表文章　用），以保存完整之资料。

　　必须指出，肾组织冰冻切片的免疫荧光染色法特异性强、敏感度高，对荧光标记物的分布部位、分布型式扩荧光强度显示极为明确。可在组织及细胞水平进行定位观察，为国际上公认的较好观察方法。但因其需要恒温冷冻切片机、荧光显微镜等昂贵设备，且切片不能长期保存为其不足之处。

　　如未能及时制作冰冻切片，亦中使用石蜡切片进行荧光染色。石虹节　片需经二甲苯脱蜡，降酒精至水，用0.1%胰蛋白酶在37℃温箱内消化20min，以暴露其抗原决定簇。再用各种荧光标记抗体按常规步骤进行染色后，荧光显微镜观察。石蜡切片之荧光观察效果不佳，其结果仅可作为参考。

　　（二）免疫酶标细胞化学技术的应用

　　由于免疫荧光技术的应用受一定的条件限制，1966年Nakane 使用辣 根过氧化物酶（HRP）代替荧光素对抗体进行标记，通过酶的显示使抗原定位，称为酶标记抗体技术。其后，1969年Mason,1970年Sternberger又在基础上发展了非标记酶抗体法。包括酶桥法和过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法（PAP）。这一技术的建立，为医学、生物学的各个领域提供了一个很好的研究手段，在免疫学和免疫病理学的研究和诊断工作中已日益广泛应用。

　　1．免疫酶标技术及其进一步发展　　免疫酶标细胞化学技术较免疫荧光细胞化学技术有不少优点。首先，酶标法染色之切片使用普通的光学显微镜即可观察，切片可以长期保存；用苏木素进行细胞核的重复染色后，还能对组织结构和抗原进行细致确切的观察和定位。PAP法的特异性和敏感性皆优于荧光抗体法，且操作简便，适合于一般实验室应用（详见第四章　）。

　　免疫酶标技术以明确的颜色（棕褐色或鲜红色）显示抗原沉积的形式（细线状、颗粒状或团块状），又可精确地定位，不但可以判断抗原沉积于肾小球毛细血管壁或系膜区，也可辨别出抗原在毛细基血管基底膜内外侧的沉积部位。故免疫酶标法在此方面的优于免疫荧光法，但其反应强度受力人为因素干扰较大（如作用时间的长短、抗体浓度的差别等），且有时背景出现非特异性染色，而影响对结果的判断。如果组织内源酶未消除干净，亦可出现假阳性结果。

　　近年来，由于单克隆抗体的制备成功和应用，推动了免疫细胞化学技术的进一步发展。单克隆抗体是通过细胞融合技术，建立杂交瘤细胞株而产生的高纯度抗体。由于免除了抗原种或株间的交叉反应，因而提高了抗原抗体反应的特异性和敏感性。在肾脏疾病的研究中，主要用于肝炎病毒抗原的检测，如使用抗HBsAg或抗HBeAg单克隆抗体，用ABC法检测肾小球中肝炎病毒抗原的存在部位和数量等。

　　目前，由于分子生物学的进展，原位核酸分子杂交技术已与免疫细胞化学技术相结合，而成为分子杂交免疫细胞化学技术（详见第二十章　）。这一技术在病理学上的应用可以从核酸及其功能活动水平上，在细胞或组织的原位显示有助于诊断或研究的信息。目前常使用乙型肝炎病毒（HBV）的DNA标记后作为探针，研究乙肝病毒相关性肾炎肾组织中HBV-DNA之存在状态。

　　2．光学显微镜观察及摄影技术　　由于免疫酶标技术的应用，使用光学显微镜可对肾组织内沉积的抗原性物质（包括免疫复合物）进行定性、定位及定量观察。例如肾小球内沉积的IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白C1q、C3等补体成分以及纤维连接。蛋白（fibronectin）和HBV病毒抗原等的存在部位、分布形式和状况及量的多少，并结合形态学观察，研究其与形态学变化之间的关系。观察时常需使用油镜。观察结果需进行摄影记录。摄影时应使用研究用显微镜附有摄影设备及自动曝光装置。摄影技术在具备自动曝光设备条件下简便易行，但滤光片之选择甚为重要。在拍摄彩色反转片（制作幻灯片时）时，应使用灯光型彩色反转片，滤光片无需使用，直接用钨丝灯泡之黄光即可进行摄影。如使用普通之日光型彩色反转片时 ，则需使用蓝色滤光片。在拍摄彩色负片（制作彩色照片用时），由于皆为日光型胶片，故需使用蓝色滤光片。拍摄彩色胶片时，首先需注意胶卷之感光度，应将自动曝光装置调至相应位置；另需在拍摄每张胶片前皆需调节　色温，以保证获得良好的彩色效果。在拍摄黑白胶片（供发表论文用）时，应使用绿色滤光片，以加强反差，提高摄影效果。

　　（三）电镜免疫细胞化学技术的应用

　　免疫电镜在细胞超微结构水平应用抗原与相应抗体能特异性结合的原理，使用标记抗体对细胞内存在的抗原性物质进行定性、定位和定量观察，是免疫细胞化学技术在亚细胞水平的进一步发展。

　　1．免疫电镜标本制备　　肾脏组织的免疫电镜标本制备与一般透射电镜标本的制备有所不同，其具体步骤如下：

　　（1）固定与包埋：肾脏组织一般采用低浓度戊二醛为固定剂，而不使用锇酸，以尽可能多地保存抗原活性，常使用甲醛-戊二醛固定液（甲醛4%，戊二醛0.05%~0.5%）。包埋剂常使用 Lowicryl K4M（丙烯酸酯类化合物）或LRWhite 树脂在-20~35℃低温下包埋，以紫外线照射使之聚合。避免使用常规之环氧树脂包埋，因环氧树脂需加热使之聚合，而使标本之抗原活性下降。

　　（2）修块、定位及切片：包埋后之组织块经初步修块后，先在超薄切片机上用玻璃刀（勿用钻石刀）切出一张0.5~1μm厚的半薄片，用1%硷性复红或美蓝溶液进行染色，在光镜下观察组织内肾小球的数量及病变情况，挑选出一个病变最为典型的肾小球，作出标记。然后在组织块上定出相应部位，用刀切去周围组织，修成约0.1mm大小之组织块，再用超薄切片机切出500 。A厚度的超薄切片。

　　（3）免疫标记：目前应用最多的是胶体金标记抗体（详见第七章　）。

　　2．免疫电镜观察　　肾组织标本皆采用包埋后染色，第一抗体为特异性抗血清（如兔抗人IgG），第二抗体为胶体金标记之抗体（如猪抗兔IgG，金标记Au10）。最后用枸椽酸铅（或醋酸铅）作对照染色，在透射电镜下观察。根据金颗粒的分布状况，可作定位、定性及定量观察，了解肾小球超微结构成分的变化、探讨肾脏疾病的病原及研究免疫复合物（沉积之电子致密物质）的组成成分等（详见后）。

　　二、血清或肾脏洗脱液的检查

　　肾脏疾病时，血清学检查亦甚为重要，现仅就与免疫细胞化学有关者介绍如下：

　　1．血清或肾脏洗脱液内抗肾小球基底膜抗体的测定　　在快速进行性肾小球肾炎（RPGN）及Goodpasture综合征病人血清中常存在有抗肾小球基底膜抗体，对病人血清进行检查有重要的诊断意义。动物实验中，对马杉氏肾炎等实验性肾小球肾炎动物，进行肾脏洗脱液的检查，以确定有无抗肾小球基底膜抗体的存在。一般常用免疫细胞化学技术进行检查，先将病人血清与灵长类（如猴等）的肾组织冰冻切片在37℃湿盒内孵育半小时，再将切片用FITC荧光素或HRP标记的抗人Igg 抗体处理。如果病人血清中存在有抗肾小球基底膜抗体，即可与切片上的肾小球基底膜相结合，进一步与荧光标记抗人IgG抗体相反应，而显示沿肾小球毛细血管壁呈连续线形之荧光分布（酶标抗体亦显示同样之连续线形分布）。本方法又可用于与抗肾小管基底膜抗体和抗核抗体的鉴别。

　　2．血清中循环免疫复合物内IgG亚类的分析　　以3%聚乙二醇（PEG）沉淀病人血清中大分子蛋白质，分别使用鼠抗人IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的单克隆抗体，以ELISA法测定免疫复合物内IgG亚类的分布状况。以同样方法亦可测定肾小球中沉积的免疫复合物内的IgG亚类。Noel 报道，不同肾炎时肾小球内沉积之IgG亚类有所不同。原发性膜性肾炎之沉积物为Igg 1和IgG4，狼疮性肾炎之沉积物为IgG1、IgG2和IgG3。

　　3．血清中Tamm-Horsfall糖蛋白（THP）的测定　　 THP是由肾小管髓袢升支厚壁段及远曲小管上皮细胞合成的糖蛋白，主要存在于正常人的尿中，血清中含有微量。当肾功能减退时，血及尿中THP明显降低，尿毒症时则血及尿中几乎测不出THP。目前可使用抗THP单克隆抗体，用ELISA夹心法测定血清中THP的含量。第一抗体使用鼠抗人THP单克隆抗体，第二抗体为HRP标记的兔抗鼠IgG。

　　4．其它　　血清中自身抗体如抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗Sm抗体等的测定，对狼疮性肾炎有诊断意义。抗着丝点抗体的测定对进行性系统性硬化（硬皮病）有诊断意义，以上测定皆使用免疫荧光法，具体操作不再赘述。

　　三、尿液的检查

　　1．尿中THP测定　　如前所述，使用抗THP单克隆抗体进行测定。除在慢性肾功能损害时血中及尿中THP下降以外，目前提出当肾移植急性排斥反应时或毒性物质导致肾小管大量破坏时，尿中可出现THP升高。

　　2．尿中抗体包裹细菌的测定　　尿路感染可分为上尿路感染（肾盂肾炎）和下尿路感染（膀胱炎、尿道炎及前列腺炎）。上尿路感染时，细菌来源于肾组织，机体对细菌产生抗体而包裹于细菌表面，形成抗体包裹细菌（ACB）。抗体为IgG、IgA或IgM组成，可用荧光素标记的抗人lgG、lgA、或lgM与之结合而使其显示荧光。反之，下尿路感染之细菌，一般不能形成抗体包裹细菌，用免疫荧光检查常为阴性，故能对上下尿路感染进行鉴别诊断。

　　3．尿沉渣中管型及粘液丝中免疫球蛋白之测定　　使用直接荧光进行观察，肾小球肾炎病人尿沉渣中管型及粘液丝可观察到IgG、IgA或IgM。一般认为是由于病变肾小球漏出之免疫球蛋白，与肾小球内沉积之免疫球蛋白可能无关。但泌尿系感染时尿中粘液丝中很少检出免疫球蛋白。故本检查有助于肾小球肾炎与泌尿系感染的鉴别。

　　四、肾小球细胞的体外培养

　　肾小球的固有细胞有3种，即系膜细胞、脏层上皮细胞及内皮细胞。近年来随着细胞培养技术的发展，肾小球的体外培养亦受到了重视。1969年Bernik首先在体外培养肾小球成功，并初步培养出系膜细胞，1975年Fish 正式分离培养系膜细胞获得成功，1978年Kreisberg分离培养上皮细胞成功，1984年Striker分离培养内皮细胞成功。目前，国内亦有不少单位从事肾小球细胞体外培养工作，已取得一定成绩。肾小球细胞的体外培养，不仅限于正常人及兔、鼠等动物，目前亦发展至肾脏病人肾穿刺组织进行细胞培养。经体外培养的一生长之原代培养细胞需进行鉴定，除使用光学显微镜及电子显微镜观察其形态及结构外，尚需进行免疫细胞化学染色而使用一系列免疫酶标记的相应抗体。例如使用抗结蛋白（desmin）单克隆抗体和抗肌动蛋白（actin）单克隆抗体（ABC试剂盒），对上皮细胞进行鉴定，二者皆为强阳性。使用抗细胞角蛋白（cytokerfatin）单克隆抗体（ABC试剂盒），对上皮细胞进行鉴定，以硷性磷酸酶为底色，上皮细胞胞浆内可见红色颗粒。内皮细胞之鉴定则使用抗Ⅷ因子单克隆抗体（因第Ⅷ因子只在内皮细胞内生成）。