1994～1997年深圳地区流感病毒活动及H3N2亚型毒株HA1基因演变特点

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第3期第13卷 论著

作者：程小雯　李良成　何建凡

单位：580020　深圳市卫生防疫站

　　关键词: 流感病毒，H3N2亚型；基因，病毒

　　【摘要】　目的　了解近几年流感病毒在深圳地区活动的特点及甲3(H3N2)亚型毒株HA1基因演变概况。方法　病毒分离采用常规的鸡胚双腔接种，毒株检定用常量半加敏HI测定。新鲜收获含病毒粒的鸡胚尿囊液用来提取RNA，经逆转录合成cDNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定。结果　近几年来深圳地区流感活动概况与全国情况相一致：在人群中仍同时流行H3N2，H1N1亚型和乙型毒株，当甲型毒株活动减弱时，乙型毒株活动就增强，反之，甲型毒株增强时，乙型毒株就减弱。随着时间的推移，H3N2亚型毒株HA1基因不断地发生点突变，这种突变严重受人群免疫压力所影响，1996年的毒株与1995的毒株相比，不仅氨基酸替换点中多数是位于抗原决定簇区或受体结合部位上，并增加两个糖基化位点，故导致H3N2毒株於1996年活动明显增强。结论　近来在深圳地区人群中仍同时流行着H3N2，H1N1亚型和乙型流感病毒。然而，不同年其优势毒株是不一样的。1996年H3N2毒株活动增强是由于其HA1区氨基酸序列发生替换所造成。

The feature of influenza virus activity and genetic characterization of HA1 gene of influenza A H3N2 viruses isolated from 1994～1997 in Shenzhen

CHENG Xiaowen, LI Liangcheng, HE Jianfan.

　　(Municipal Hygiene and Anticepidemic Station of Shenzhen, Shenzhen 580020)

　　【Abstract】　Objective　To understand the feature of influenza virus activity and genetic characterization of HA1 gene of influenza A H3N2 viruses isolated in recently years in Shenzhen.Methods　The specimens were inoculated into amniotic and allantoic cavities of the embryonated chicken eggs for viral isolation. The isolates were typed with HI test. Virion RNA extracted from allantoic fluid by Rneasy RNA extraction kit was used for RT-PCR amplification. Afterward, the product of PCR was purified with purification kit. RNA sequence analysis was performed by Sanger dideoxy-mediated nucleotide chain termination method.Results　Influenza A H3N2, H1N1 and B viruses were cocirculating in men in Shenzhen in recent years. However, the extent of their activities was not the same in a single year. The influenza B virus was the predominant strain in 1994 and 1997, but the predominant strain was H3N2 virus in 1996. The genetic analysis showed that the substitution of amino acids occured year by year and was mainly located at antigenic determinants or receptor binding site on HA1 domain of H3N2 viruses.Conclusion　Influenza A H3N2, H1N1 and B viruses were still co-circulating in men in Shenzhen in recent years, the predominant strain of influenza virus was different in different years. An increase of influenza A H3N2 virus activity in 1996 was due to the substitution of amino acids sequences on viral HA1 domain.

　　【Key words】　Influenza A(H3N2) virus　　Gene, virus

　　我们对1994年以来流感病毒在深圳地区人群中活动概况进行分析，从分子生物学角度了解近几年来甲3(H3N2)亚型毒株HA1基因演变概况，尤其想弄清它于1996年活动明显加强的分子生物学基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本采集及处理　1994～1997年，每周从深圳市某一监测医院采集类流感患者咽拭子5～10份，按常规加双抗处理，然后，按常规每份标本双腔接种9～10日龄鸡胚3只，35℃孵育72 h，收获，检查血凝活性。

　　1.2　分离物鉴定　凡所收获的羊水或尿液红细胞凝集阳性的滴定其HA滴度，然后用红细胞凝集抑制法(HI)进行初步鉴定(鉴定血清来自国家流感中心)。HA滴度过低者经鸡胚传代再进行鉴定。最后将阳性标本送家国流感中心进行复核鉴定。

　　1.3　病毒　A/深圳/203/95(H3N2)，A/深圳/160/96(H3N2)和A/深圳/223/97(H3N2)由深圳市卫生防疫站分离。国际代表株A/武汉/395/95(H3N2)毒株的HA1基因及其所编码的氨基酸序列由国家流感中心提供。深圳和武汉以下由WH和SZ表示之。

　　1.4　病毒RNA的提取　见文献［1］。

　　1.5　引物　³⁵S-ATP，逆转录酶、PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒以及Sequence System试剂盒均由国家流感中心提供。

　　1.6　cDNA合成和聚合酶链反应　见文献［2］。

　　1.7　核苷酸序列测定　采用双脱氧链终止法^［3］，基本步骤参考USB公司DNA sequence试剂盒。

　　2　结果

　　2.1　1994～1997年流感病毒在深圳地区活动特点　从图1可看出，当前深圳地区人群中仍同时流行甲3(H3N2)，甲1(H1N1)亚型和乙型流感病毒，它们相互间有相克现象即当甲型流感病毒活动减弱时，乙型毒株活动加强，如1994和1997年。反之，当甲型毒株活动加强时，乙型毒株活动就减弱，如1996年。但不是每年都这样，它们有共同低潮时期，如1995年。

图1　1994～1997年深圳地区流感病毒活动情况

　　fig.1　The influenza virus activity in Shenzhen city, 1994～1997

　　2.2　H3N2亚型毒株HA1基因核苷酸序列测定　随机取1995～1997年间每年所分离出的毒株各1株SZ95-203，SZ96-160，SZ97-233，对其HA1基因进行核苷酸序列测定，结果为便于分析和比较，将所测出的核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列及参照毒株A/武汉/395/95(H3N2)的HA1蛋白分子的氨基酸序列一同列于图2。3株测定毒株与参照毒株一样，其HA1蛋白分子上均含328个氨基酸，它们的重链(HA1)和轻链(HA2)连接处仅含一个精氨酸(R)。它们与参照毒株间有共同的8个(8，22，38，63，126，165，246和285位)糖基化位点。1996年和1997年的毒株并1995年(包括参照毒株)毒株多两个(122和133位)糖基化位点。尤其133是位于受体结合部位(RBS)的前壁上。其次1996和1997年毒株与1995年毒株相比较差异的位点还有：81，82，88，92(均位于E抗原区)，124(A抗原区)，142，156(B抗原区)和226(位于RBS的左壁)。这些结果清楚表明，1996年毒株与1995年毒株相比较，其HA1蛋白分子上氨基酸序列的差异，绝大多数是位于抗原决定簇区或RBS，同时还多了两个糖基化位点，这就很容易解释为何1996年H3N2毒株活动明显加强。从图2还可看出，1997与1996年毒株不同的位点有：76，78，81，82，92，94(后5个均位于抗原决定簇不重要的E区)，156(B抗原区)，190和194(RBS后壁，是保守区)和276。也就是说，这些差异中仅156是发生在较为重要的部位。而1995毒株与参照毒株相比较仅有5个位点不同，仅156位于抗原决定簇B区，其余4个均位于不重要位点上。除此而外，图2还表明，3毒株随时间推移与参照毒株的差异数增加，即同源性下降。其结果见表1。

表1　H3N2亚型毒株HA1蛋白区氨基酸序列的同源性

　　Tab.1　Homology of amino acid sequences on HA1 domain among influenza A(H3N2) viruses

图2　H3N2亚型流感病毒HA1区蛋白分子上氨基酸序列比较

　　“-”表示糖基化位点

　　Fig.2　The deduced amino caid sequences of the HA gene HA1 region of the three H3N2 viruses compared withthat of one reference strain“-”indicated potential glycosylation site

　　3　讨论

　　1994～1997年深圳地区流感病毒活动概况与全国情况相一致(见流感简报1994～1997年)。但抗原性和基因特性分析还是有不同之处，如1994年我国各地流行的乙型流感病毒为B/巴拿马/45-/190类毒株，而我市为B/维多利亚/2/87类毒株^［4］。

　　基因分析清楚表明，1996年H3N2毒株活动加强，是由于病毒粒HA1蛋白分子上重要部位氨基酸发生了替换，并96毒株HA1区多了两个糖基化点。

　　近来研究表明，糖具有防止HA蛋白被水解，稳定HA蛋白的结构，妨碍抗体对病毒粒的识别和清除等功能^［5］。所以如果糖基化点改变发生在抗原决定族就会妨碍特异抗体对病毒粒的识别和清除^［6］，就会造成抗原性漂移；如果改变发生在HA1和HA2连接处的附近，就影响蛋白酶对HA水解，并影响病毒粒的感染性和致病性^［8，9］；如果改变是发生在RBS或其附近就会改变病毒粒对宿主细胞表面受体的认别和结合^［5］。Kawaoka等人^［10］还报道了糖基化点的改变会造成病毒致病性改变。而1996年毒株比1995年的多两个糖基化位点：133(位于RBS前壁)和121(位于RBS的附近)。不少报道^［11］266位点在决定病毒株对宿主细胞表面受体特异性方面起着极重要的作用。至于1996与1965年毒株间有如此的差异，导致1996年H3N2毒株“O”相特性的出现，由于比较毒株过少难下肯定的结论。

　　参考文献

　　1　郭元吉，董婕，王敏，等.甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(1)：18-22.

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　　4　国家流感中心.流感简报，1994.

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　　6　Munk K, Pritzer E, Kertzschmar B, et al. Carbohydrate masking of an antigenic epitope of influenza virus hemagglutinin independent of oligosaccharide size. Glycobiology, 1992, 2:233-240.

　　7　Seidel W, Kunkel B, Geisler W, et al. Intraepidemic variants of influenza virus H3 hemagglutinin differing in the number of carbohydrate side chains. Arch Virol 1991, 120:289-296.

　　8　Deshpande K S, Fried V A, Ando M, et al. Glycosylation affects cleavage of an H5N2 influenza virus hemagglutinin and regulates virulence. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:36-40.

　　9　Ohuchi M, Orlich M, Ohuchi R, et al. Mutations at cleavage site of the hemagglutinin alter the pathogenicity of influenza virus A/chick/Penn/83 H5N2.virology, 1989, 168:274-280.

　　10　Kawaoka Y, Naeve C W, Webster R G. Is virulence of H5N2 influenza A viruses in chickens associated with loss of carbohydrate from the hemagglutinin? Virology, 1984, 139:303-316.

　　11　Webster R G, Bean W J, Gorman O T, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiological Reviews, 1991,56(1):152-179.

(收稿：1998-08-17　　修回：1998-12-20)